國外病原微生物快速檢測鑒定技術(shù)研究進展

在受生物污染或生物武器攻擊的戰(zhàn)場上，越早檢測出生物戰(zhàn)劑的種類，越能快速適配治療方案，降低傷亡，直接關(guān)系部隊的戰(zhàn)斗力和人員安全。目前，國外相關(guān)領(lǐng)域的研究正將病原微生物檢測能力從實驗室推向戰(zhàn)場前沿。

一、基礎(chǔ)研究方向

1.1從樣本到到答案(sample-to-answer)一體化系統(tǒng)

長久以來，病原體快速檢測仍以PCR(鏈式聚合酶反應(yīng))技術(shù)為主，但其發(fā)展方向開始從操作復(fù)雜的實驗室設(shè)備轉(zhuǎn)向小型自動化和低操作門檻的便攜式設(shè)備。

從樣本到到答案一體化系統(tǒng)的目標是將樣本處理、核酸提取/富集、擴增、檢測、判讀等一系列操作過程封裝在一次性密封耗材和一個小型儀器內(nèi)，操作者只需進行極少的步驟，系統(tǒng)即可自動給出定性或定量結(jié)果。

表.從樣本到到答案(sample-to-answer)一體化系統(tǒng)的組成

美國國防部自2017財年起開始采購由美國BioFire Defense公司研發(fā)的Film Array 2.0，該系統(tǒng)可檢測臨床樣本(血液、痰液等)和環(huán)境樣本(空氣、土壤和水)中的生物戰(zhàn)劑(炭疽、鼠疫、土拉弗雷熱、Q熱、埃博拉和馬爾堡病毒等)，任何人員(包括無技術(shù)背景的人員)可在2分鐘內(nèi)完成上樣，并在1小時內(nèi)出具檢測結(jié)果。

圖. Film Array 2.0系統(tǒng)

另一種被美軍廣泛使用的設(shè)備是美國Cepheid公司的GeneXpert系統(tǒng)。該系統(tǒng)具備多通道檢測能力，可在45分鐘內(nèi)出具結(jié)果。2022年，美軍與該公司簽訂了5.6億美元的合同用于相關(guān)設(shè)備的采購。

圖. GeneXpert 4和GeneXpert 16系統(tǒng)

1.2 CRISPR分子診斷

CRISPR分子診斷(CRISPR-Dx)是基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的特異性核酸識別能力，利用Cas12/Cas13蛋白被靶序列激活后的“旁切活性”切割熒光報告分子，實現(xiàn)快速信號輸出。

相比于傳統(tǒng)PCR技術(shù)，CRISPR分子診斷的特異性強、可擴展性強、適用范圍廣、靈敏度極高，因此很適合用于新病原的檢測。然而其熒光報告強度和反應(yīng)動力學(xué)受溫度和樣本抑制等影響，因此整個反應(yīng)體系并不十分穩(wěn)定。

圖.幾種CRISPR分子診斷系統(tǒng)的原理

2022年，美國Sherlock Biosciences公司(CRISPR系統(tǒng)的發(fā)明者成立的公司)的產(chǎn)品便采用該技術(shù)，已通過FDA的審核用于新冠病毒的檢測，但是由于嚴格的質(zhì)量控制、批間一致性、干擾驗證等因素，該試劑盒僅限于緊急情況下使用。

1.3宏基因組與第三代測序

宏基因組測序(mNGS)是一類非靶向的核酸檢測方法,通過對樣本中所有的核酸樣本進行高通量測序，再通過生物信息學(xué)的方法對結(jié)果進行識別，從而在一次檢測中同時覆蓋細菌、病毒、真菌、寄生蟲等多類微生物，并能在混合感染或非常規(guī)病原場景下提供額外檢出價值。

第三代測序是指長讀長測序(long-read sequencing)，主要的技術(shù)平臺是納米孔測序(ONT)，可以實現(xiàn)邊測序邊分析，準確率達到99%以上，從樣本到初步結(jié)果的時間僅需數(shù)小時甚至更短。納米孔測序設(shè)備的尺寸十分小巧(通常只有手掌心大小)，可以直接連接到電腦，實時讀取檢測結(jié)果。

圖.納米孔測序原理(左圖)和設(shè)備(右圖)

1.4宿主反應(yīng)(host-response)

相比于前幾種技術(shù)，基于宿主反應(yīng)的檢測技術(shù)并不是檢測病原體本身，而是檢測人體在感染后產(chǎn)生的免疫-炎癥反應(yīng)模式，用這些反應(yīng)模式去判斷是否感染以及感染病原的類型、病情嚴重程度和進展風(fēng)險。它的優(yōu)勢在于，當(dāng)病原載量很低、取樣部位不理想或病原突變導(dǎo)致靶標檢測漏檢時，宿主反應(yīng)仍可能給出“機體免疫系統(tǒng)已經(jīng)被病原激活”的信號;同時還能在一定程度上區(qū)分感染與無菌炎癥，從而支持抗菌藥物的更精細決策。

目前，制約病原微生物快速檢測鑒定技術(shù)發(fā)展的主要瓶頸是樣本的前處理，主要原因在于：

(1)低載量：在感染早期、用藥后或血流感染時樣本里病原體的含量較少，檢測難度高。

(2)強抑制物/復(fù)雜基質(zhì)：血液、痰液、糞便、土壤/污水里有會抑制擴增/酶反應(yīng)或干擾傳感器讀數(shù)的成分。

(3)裂解與回收效率差異大：革蘭陽性菌、分枝桿菌、真菌、芽孢、包膜病毒等難裂解的樣本會導(dǎo)致假陰性風(fēng)險上升。

(4)富集和速度的矛盾：更靈敏的檢測技術(shù)往往要對樣本進行富集和純化，但這會直接拖慢檢測速度。

二、美軍的相關(guān)研究項目

美國國防高級研究計劃局(DARPA)推動了多個病原微生物檢測技術(shù)的研發(fā)項目，包括利用基因編輯技術(shù)進行檢測項目(DIGET)和表觀遺傳特征和觀察項目(ECHO)。

2.1 利用基因編輯技術(shù)進行檢測項目(DIGET)

DIGET項目由DARPA于2019年發(fā)起，項目周期4年(目前已完成)，依托CRISPR-Cas12/Cas13基因編輯技術(shù)，結(jié)合等溫擴增、微流控、合成生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)，目標是解決美軍對快速、高可信度、可靈活適配的診斷與生物監(jiān)測技術(shù)的迫切需求。對于該項目，美軍要求承包商交付2種產(chǎn)品：

(1)一次性即時診斷試劑盒，可檢測多達10種病原體和宿主生物標志物。

(2)用于同時檢測1000個或更多樣本的可復(fù)用檢測設(shè)備。

表. DIGET項目的技術(shù)要求

2.2 表觀遺傳特征和觀察項目(ECHO)

ECHO項目于2018年發(fā)起，周期4年(目前已完成)，目標是解決大規(guī)模殺傷性武器(WMD)及前體暴露檢測的痛點，即現(xiàn)有方法依賴殘留的生物痕跡(易消失、濃度低)，且需實驗室環(huán)境，無法在野外快速應(yīng)用。項目通過分析個人表觀基因組，和暴露后的持久分子印記，實現(xiàn)對WMD暴露的溯源與診斷，支撐軍事反恐及防擴散任務(wù)。

該項目基于RNA-SEQ(基因表達分析)、ChIP-SEQ(組蛋白修飾檢測)、WGBS(DNA甲基化分析)等分子生物學(xué)方法結(jié)合生物信息學(xué)工具和微流控技術(shù)，交付2種產(chǎn)品：

(1)ECHO特征檢測板：可檢測21種暴露特異性特征(4種必選生物制劑+17種自選類別，涵蓋化學(xué)、放射性、爆炸物等10類)，可區(qū)分暴露類型及暴露時間。

(2)便攜式集成檢測設(shè)備：集成樣本處理、表觀遺傳分析、結(jié)果解讀功能，適用于野外環(huán)境，無需專業(yè)操作人員。

表. ECHO項目的技術(shù)要求

三、總結(jié)

總體來看，國外病原體快速檢測技術(shù)發(fā)展的共性特點與趨勢如下：

(1)速度和可適配并重：不僅追求分鐘級到小時級出結(jié)果，也強調(diào)新靶點快速上線與大通量檢測。

(2)從檢病原走向檢狀態(tài)：通過宿主反應(yīng)和表觀遺傳等方法，把檢測目標從特定病原轉(zhuǎn)向機體狀體，提升檢測的廣譜性。

(3)面向戰(zhàn)場前沿：為滿足戰(zhàn)場的使用需求(檢測速度快，人員要求低)，檢測設(shè)備向小體積、低功耗、低操作難度、結(jié)果準確、直觀易懂的方向發(fā)展。(北京藍德信息科技有限公司)