Phytomedicine (中科院1區(qū)-TOP期刊）I 破局骨質(zhì)疏松：松果菊苷靶向HSC70，斬?cái)嗥乒羌?xì)胞過(guò)度激活通路! (李萍/李飛-中國(guó)藥科大學(xué))

2026年4月10日，中國(guó)藥科大學(xué)天然藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李萍、李飛團(tuán)隊(duì)聯(lián)合新疆第二醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院李建光團(tuán)隊(duì)、江蘇省中醫(yī)院/南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨科王磊團(tuán)隊(duì)，在Phytomedicine（中科院1區(qū)TOP期刊，IF=8.3）在線發(fā)表題為 “Echinacoside targets HSC70 to inhibit osteoclastogenesis and ameliorate ovariectomy-induced osteoporosis” 的研究論文。該研究聚焦天然產(chǎn)物松果菊苷（Echinacoside, ECH）抗骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵靶點(diǎn)與分子機(jī)制，首次系統(tǒng)揭示HSC70是ECH調(diào)控骨重塑、抑制破骨細(xì)胞生成的重要直接靶點(diǎn)。

骨質(zhì)疏松癥是最常見(jiàn)的代謝性骨病之一，其核心病理在于骨形成與骨吸收失衡，尤其是破骨細(xì)胞過(guò)度活化導(dǎo)致骨量快速丟失。現(xiàn)有治療策略多集中于促進(jìn)成骨或抑制骨吸收的單一環(huán)節(jié)，而能夠兼具“促成骨—抗破骨”雙重調(diào)控潛力的藥物仍相對(duì)有限。因此，尋找新的骨重塑調(diào)控靶點(diǎn)，并開(kāi)發(fā)精準(zhǔn)干預(yù)策略，是骨質(zhì)疏松防治領(lǐng)域的重要方向。

松果菊苷是來(lái)源于肉蓯蓉的天然苯乙醇苷類化合物，既往研究提示其具有改善骨丟失的潛力，但其是否能夠直接調(diào)控破骨細(xì)胞生成，以及背后的精確靶點(diǎn)仍不清楚。本研究通過(guò)小分子親和層析、LC-MS/MS蛋白篩選、分子動(dòng)力學(xué)模擬、RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成模型、OVX誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松大鼠模型以及臨床樣本驗(yàn)證，構(gòu)建了從“靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)—機(jī)制解析—?jiǎng)游矧?yàn)證—臨床相關(guān)性觀察”的完整證據(jù)鏈。

研究發(fā)現(xiàn)，HSC70是松果菊苷發(fā)揮抗破骨細(xì)胞生成作用的關(guān)鍵細(xì)胞靶點(diǎn)。分子動(dòng)力學(xué)模擬進(jìn)一步確認(rèn)，HSC70的ARG36和ARG272是ECH結(jié)合的主要氨基酸位點(diǎn)，二者共同支撐了ECH-HSC70復(fù)合物的穩(wěn)定形成。更重要的是，HSC70在骨質(zhì)疏松細(xì)胞模型、OVX大鼠模型以及臨床骨質(zhì)疏松患者樣本中均呈現(xiàn)明顯上調(diào)，提示HSC70不僅是一個(gè)藥物結(jié)合靶點(diǎn)，更可能是參與骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控因子。

機(jī)制上，ECH通過(guò)靶向HSC70促進(jìn)IKKβ發(fā)生泛素化介導(dǎo)的降解，從而抑制IKKβ-NF-κB信號(hào)軸活化，最終阻斷破骨細(xì)胞分化及骨吸收功能。與ECH處理結(jié)果一致，敲低Hsc70同樣能夠抑制TRAP陽(yáng)性破骨細(xì)胞形成、F-actin環(huán)形成及骨吸收活性，進(jìn)一步證明HSC70在破骨細(xì)胞生成中的關(guān)鍵作用。

在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，ECH顯著改善OVX誘導(dǎo)的大鼠骨丟失和骨代謝紊亂，提高骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)量和骨小梁厚度，并降低骨吸收相關(guān)指標(biāo)。進(jìn)一步的功能驗(yàn)證顯示，Hsc70過(guò)表達(dá)可在正常大鼠中誘導(dǎo)骨丟失，而Hsc70敲低則可緩解OVX大鼠骨丟失；同時(shí)，無(wú)論過(guò)表達(dá)還是敲低Hsc70，均會(huì)削弱甚至消除ECH的治療作用，說(shuō)明ECH的抗骨質(zhì)疏松效應(yīng)高度依賴其對(duì)HSC70的靶向調(diào)控。

該研究的亮點(diǎn)在于：一方面，從天然產(chǎn)物松果菊苷出發(fā)，明確了其抗骨質(zhì)疏松作用的直接靶點(diǎn)HSC70；另一方面，揭示了“HSC70—IKKβ泛素化降解—NF-κB信號(hào)抑制—破骨細(xì)胞生成受阻”這一新的骨重塑調(diào)控軸。研究不僅拓展了HSC70在代謝性骨病中的功能認(rèn)識(shí)，也為松果菊苷作為新型HSC70抑制劑的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供了重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

總體來(lái)看，該研究將天然藥物活性成分、靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)技術(shù)和骨代謝疾病機(jī)制研究緊密結(jié)合，提出了以HSC70為核心的骨質(zhì)疏松精準(zhǔn)干預(yù)新思路。松果菊苷有望作為兼具天然產(chǎn)物優(yōu)勢(shì)和明確分子靶點(diǎn)的新型候選藥物，為代謝性骨病治療提供新的轉(zhuǎn)化方向。

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【摘要】

背景：松果菊苷（ECH）是一種從肉蓯蓉中分離獲得的天然苯乙醇苷類化合物，在抗骨質(zhì)疏松癥（OP）方面顯示出良好的治療潛力。然而，其具體分子靶點(diǎn)及相關(guān)作用機(jī)制尚未完全闡明。

目的：本研究結(jié)合小分子親和層析、RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成模型以及卵巢切除（OVX）誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松模型，系統(tǒng)探討ECH發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用的分子靶點(diǎn)及機(jī)制。

方法：采用小分子親和層析和分子動(dòng)力學(xué)模擬鑒定ECH的直接分子靶點(diǎn)及其潛在結(jié)合位點(diǎn)。隨后，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，利用RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成模型進(jìn)一步闡明ECH調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制。最后，在OVX誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松模型中驗(yàn)證ECH的體內(nèi)抗骨質(zhì)疏松作用。

結(jié)果：本研究發(fā)現(xiàn)，熱休克同源71 kDa蛋白（HSC70）是ECH調(diào)控破骨細(xì)胞生成的關(guān)鍵細(xì)胞靶點(diǎn)。HSC70的ARG36和ARG272氨基酸被證實(shí)為ECH的主要結(jié)合位點(diǎn)。值得注意的是，HSC70在骨質(zhì)疏松模型和臨床患者樣本中均顯著上調(diào)。從機(jī)制上看，ECH通過(guò)促進(jìn)IKKβ的泛素化介導(dǎo)降解來(lái)抑制破骨細(xì)胞生成。此外，敲低Hsc70表現(xiàn)出與ECH處理相似的生物學(xué)效應(yīng)。體內(nèi)研究證實(shí)，ECH通過(guò)靶向HSC70，顯著改善OVX誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松模型中的骨丟失和代謝紊亂。具體而言，Hsc70過(guò)表達(dá)可在正常大鼠中誘導(dǎo)骨丟失；相反，Hsc70敲低可緩解OVX大鼠的骨丟失。此外，Hsc70過(guò)表達(dá)和敲低均會(huì)消除ECH在OVX大鼠中的治療作用。

結(jié)論：本研究揭示HSC70是骨重塑的新型調(diào)控因子，并提出ECH作為一種新的HSC70抑制劑，具有成為潛在治療藥物的前景。本研究為骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制提供了重要認(rèn)識(shí)，并為代謝性骨病提出了一種創(chuàng)新的靶向治療策略。

01

研究背景及科學(xué)問(wèn)題

骨質(zhì)疏松癥（OP）是最常見(jiàn)的代謝性骨病，主要發(fā)生于絕經(jīng)后女性。其特征是骨密度（BMD）降低和骨微結(jié)構(gòu)破壞，從而導(dǎo)致骨折風(fēng)險(xiǎn)升高。骨骼健康依賴于破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收與成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成之間的動(dòng)態(tài)平衡。OP表現(xiàn)為骨形成減少和破骨性骨吸收增強(qiáng)。針對(duì)骨重塑、同時(shí)調(diào)節(jié)合成代謝和分解代謝通路，是OP再生治療的一項(xiàng)基礎(chǔ)策略。目前OP治療主要通過(guò)促進(jìn)成骨或抑制骨吸收來(lái)降低骨折風(fēng)險(xiǎn)。多數(shù)藥物治療通過(guò)靶向成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞來(lái)控制癥狀。然而，臨床上仍缺乏能夠同時(shí)促進(jìn)骨形成并抑制骨吸收的有效藥物。

熱休克同源71 kDa蛋白（HSC70/HSPA8）是一種關(guān)鍵分子伴侶，具有組成型表達(dá)特點(diǎn)，對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，并參與蛋白折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解等過(guò)程。HSC70與疾病病理生理過(guò)程關(guān)系密切，因此被認(rèn)為是一個(gè)具有潛力的治療靶點(diǎn)。近期研究提示，HSC70與骨代謝異常之間存在緊密聯(lián)系。HSC70介導(dǎo)的PRL2自噬性降解對(duì)于破骨細(xì)胞形成和炎癥性骨破壞具有重要作用。此外，同時(shí)敲低HSC70和MNSFβ可抑制RANKL刺激下的破骨細(xì)胞形成。因此，利用天然來(lái)源小分子靶向HSC70并調(diào)節(jié)其活性，是一種有前景的OP治療方式。然而，利用天然化合物靶向HSC70以調(diào)控骨重塑，目前仍研究不足。

小分子親和層析是藥物靶點(diǎn)鑒定的有效方法。天然產(chǎn)物是藥物發(fā)現(xiàn)中生物活性化合物的重要來(lái)源。因此，探索具有骨重塑調(diào)控作用的天然化合物，有助于揭示其靶點(diǎn)及骨代謝中的新調(diào)控機(jī)制。松果菊苷（ECH）是來(lái)源于肉蓯蓉的一種活性苯乙醇苷類化合物，已顯示出神經(jīng)保護(hù)和抗癌作用。我們此前的研究表明，ECH可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，并減輕卵巢切除（OVX）大鼠的骨丟失，提示其可能具有治療OP的潛力。然而，ECH對(duì)破骨細(xì)胞生成的調(diào)控作用及其抗骨質(zhì)疏松的精確機(jī)制仍很大程度上未知。本研究旨在通過(guò)結(jié)合小分子親和層析以及一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，探討ECH對(duì)破骨細(xì)胞生成的影響，并進(jìn)一步闡明其潛在分子機(jī)制。

本研究利用ECH偶聯(lián)微珠進(jìn)行小分子親和層析，并結(jié)合后續(xù)蛋白質(zhì)譜篩選，鑒定HSC70為ECH的直接結(jié)合靶點(diǎn)。重要的是，HSC70在OP模型和臨床患者樣本中高表達(dá)。從機(jī)制上看，HSC70通過(guò)調(diào)控IKKβ泛素化來(lái)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成。ECH在體內(nèi)通過(guò)直接靶向HSC70改善OVX誘導(dǎo)的骨丟失。綜上，本研究揭示了HSC70中可用于藥物干預(yù)的骨重塑熱點(diǎn)，并提出ECH可能作為治療代謝性骨病的潛在HSC70抑制劑。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點(diǎn)

HSC70是ECH的細(xì)胞靶點(diǎn)

抑制破骨細(xì)胞生成是改善OP的有效策略。因此，我們首先在RANKL誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中評(píng)估ECH抑制破骨細(xì)胞生成的潛力。結(jié)果顯示，在最高50 μM濃度范圍內(nèi)，ECH處理未產(chǎn)生明顯細(xì)胞毒性。隨后，我們考察了ECH的抗破骨細(xì)胞生成作用。ECH處理顯著阻斷了RANKL刺激下的破骨細(xì)胞生成。此外，ECH有效抑制了RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成相關(guān)基因Nfatc1、Ctsk、c-Fos和Acp5的轉(zhuǎn)錄上調(diào)。ECH還顯著抑制了RANKL刺激的RAW 264.7細(xì)胞中F-actin環(huán)形成和骨吸收活性。總體而言，這些結(jié)果表明ECH可在體外有效抑制破骨細(xì)胞生成。

細(xì)胞靶點(diǎn)是ECH介導(dǎo)骨穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)作用的分子基礎(chǔ)。為鑒定這些靶點(diǎn)，我們構(gòu)建了ECH偶聯(lián)的環(huán)氧活化Sepharose 6B微珠（ECH beads），作為一種親和工具，用于分離可直接與ECH相互作用的蛋白。隨后采用考馬斯亮藍(lán)染色和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）對(duì)捕獲蛋白進(jìn)行可視化和鑒定。值得注意的是，在鑒定到的蛋白中，HSC70的豐度最高。因此，我們推測(cè)HSC70可能是ECH的直接細(xì)胞靶點(diǎn)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，HSC70可被ECH beads拉下，而過(guò)量游離ECH可競(jìng)爭(zhēng)性抑制這一相互作用。此外，在另一篇已接收但尚未發(fā)表的文章中，我們已通過(guò)細(xì)胞熱遷移實(shí)驗(yàn)、藥物親和反應(yīng)靶點(diǎn)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、生物層干涉技術(shù)等方法證實(shí)ECH能夠直接結(jié)合HSC70。

隨后，我們對(duì)HSC70-ECH復(fù)合物進(jìn)行了1000 ns分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬，以評(píng)估其穩(wěn)定性、柔性和緊密性。采用均方根偏差（RMSD）評(píng)估HSC70-ECH復(fù)合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。RMSD分析顯示，HSC70-ECH復(fù)合物在約200 ns模擬后達(dá)到結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。通過(guò)分析氨基酸殘基的均方根波動(dòng)（RMSF）評(píng)估殘基特異性柔性。RMSF結(jié)果顯示，HSC70的N端和C端區(qū)域具有更高的內(nèi)在柔性。這些末端區(qū)域的動(dòng)態(tài)波動(dòng)可能在調(diào)控HSC70活性及其與ECH相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。采用回轉(zhuǎn)半徑（Rg）分析監(jiān)測(cè)HSC70-ECH復(fù)合物在模擬過(guò)程中的結(jié)構(gòu)緊密性，其平均Rg值為2.52 nm。由于氫鍵對(duì)于穩(wěn)定受體-配體復(fù)合物至關(guān)重要，因此分析了HSC70與ECH之間的氫鍵。結(jié)果顯示，模擬過(guò)程中氫鍵數(shù)量逐漸增加，提示結(jié)合穩(wěn)定性增強(qiáng)。為量化結(jié)合親和力，采用MM/PBSA方法進(jìn)行分析。ECH-HSC70復(fù)合物的結(jié)合能為?36.59 kcal/mol，表明二者之間存在強(qiáng)相互作用。此外，殘基特異性能量分解分析鑒定出14個(gè)參與ECH結(jié)合的氨基酸殘基。綜上，這些結(jié)果證實(shí)ECH可直接結(jié)合HSC70并形成穩(wěn)定復(fù)合物。

HSC70的ARG36和ARG272氨基酸被鑒定為ECH的結(jié)合位點(diǎn)

殘基特異性能量分解分析顯示，有14個(gè)氨基酸殘基參與ECH結(jié)合，其中ARG36和ARG272是主要貢獻(xiàn)殘基。為驗(yàn)證這一結(jié)果，我們采用丙氨酸掃描突變，將關(guān)鍵殘基ASN35、ARG36、ASP53、GLU231、THR265、ARG272和ASN364替換為丙氨酸。上述位點(diǎn)突變顯著削弱了HSC70-ECH復(fù)合物的整體穩(wěn)定性、柔性和緊密性，其中ARG36/ARG272雙突變的影響最為明顯。這些特定位點(diǎn)突變還破壞了氫鍵形成，并提高了復(fù)合物能量和結(jié)合能，提示結(jié)合親和力減弱。綜上，MD模擬表明HSC70能夠與ECH形成穩(wěn)定復(fù)合物，其中ARG36和ARG272是高親和力結(jié)合所必需的關(guān)鍵殘基。

HSC70在OP模型和臨床患者樣本中高表達(dá)

為闡明HSC70在OP中的潛在功能，我們檢測(cè)了HSC70在OP細(xì)胞模型、動(dòng)物模型和患者樣本中的表達(dá)。qRT-PCR分析顯示，在RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成過(guò)程中，Hsc70 mRNA水平自第3天起顯著上調(diào)。同時(shí)，WB分析顯示HSC70蛋白水平在破骨細(xì)胞生成過(guò)程中升高。與此一致，我們?cè)贠VX大鼠和OP患者的骨組織中均觀察到HSC70水平升高。此外，與健康個(gè)體相比，OP患者血漿HSC70水平顯著升高。總體而言，這些結(jié)果表明HSC70表達(dá)在OP中發(fā)生失調(diào)，藥理學(xué)抑制HSC70可能是一種可行的OP治療策略。

敲低HSC70抑制破骨細(xì)胞生成

為闡明HSC70在破骨細(xì)胞生成中的功能作用，我們使用強(qiáng)效HSC70抑制劑VER-155008處理RAW 264.7細(xì)胞。結(jié)果一致顯示，VER-155008處理可抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成相關(guān)基因表達(dá)。隨后，我們研究了Hsc70敲低對(duì)RANKL刺激下RAW 264.7細(xì)胞破骨細(xì)胞生成的影響。Hsc70敲低顯著阻礙了TRAP陽(yáng)性多核破骨細(xì)胞的形成。此外，qRT-PCR分析顯示，Hsc70缺失削弱了破骨細(xì)胞生成相關(guān)基因的激活。F-actin染色結(jié)果顯示，Hsc70敲低阻斷了F-actin環(huán)形成。同時(shí)，Hsc70敲低抑制了破骨細(xì)胞的骨吸收活性。綜上，這些結(jié)果表明Hsc70敲低可抑制破骨細(xì)胞生成。

HSC70通過(guò)IKKβ-NF-κB軸調(diào)控破骨細(xì)胞生成

鑒于RANKL激活的NF-κB信號(hào)對(duì)破骨細(xì)胞生成至關(guān)重要，我們分析了RANKL刺激并經(jīng)ECH處理的RAW 264.7細(xì)胞中的NF-κB信號(hào)活性。ECH有效阻斷了RANKL誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)錄活化，并阻止NF-κB p65核轉(zhuǎn)位。類似地，VER-155008處理也抑制了RANKL觸發(fā)的NF-κB p65核轉(zhuǎn)位。值得注意的是，ECH和VER-155008均不影響總NF-κB p65蛋白水平。此外，Hsc70敲低同樣不改變NF-κB p65蛋白水平，但可阻止RANKL誘導(dǎo)的NF-κB p65入核。

進(jìn)一步研究顯示，ECH處理降低了IKKβ蛋白水平，從而導(dǎo)致RANKL處理細(xì)胞中IκBα磷酸化水平下降。Hsc70敲低同樣降低IKKβ表達(dá)，并進(jìn)一步減少IκBα磷酸化。此外，ECH處理和Hsc70敲低均促進(jìn)IKKβ降解。蛋白酶體抑制劑MG-132的使用可消除ECH誘導(dǎo)的IKKβ降解，說(shuō)明該降解過(guò)程通過(guò)蛋白酶體途徑發(fā)生，并伴隨IKKβ泛素化增加。類似地，HSC70敲低也增加了IKKβ泛素化和降解。綜上，這些數(shù)據(jù)表明HSC70通過(guò)IKKβ-NF-κB軸調(diào)控破骨細(xì)胞生成。

ECH靶向HSC70緩解卵巢切除大鼠模型中的OP

為證明ECH在體內(nèi)通過(guò)靶向HSC70抑制破骨細(xì)胞生成，我們建立了卵巢切除（OVX）誘導(dǎo)的OP大鼠模型和Hsc70過(guò)表達(dá)OVX大鼠模型（OVX+AAV9-Hsc70），并通過(guò)灌胃給予ECH處理10周。AAV9介導(dǎo)的Hsc70過(guò)表達(dá)通過(guò)OVX大鼠膝關(guān)節(jié)腔注射實(shí)現(xiàn)。ECH劑量依據(jù)既往研究設(shè)定。與Sham組相比，OVX組體重顯著升高。ECH處理輕度減弱了這種體重增加，而OVX大鼠中Hsc70過(guò)表達(dá)對(duì)體重?zé)o顯著影響。

Micro-CT分析顯示，與Sham+AAV9-Vector組相比，OVX+AAV9-Vector組的BMD、骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）和連接密度（Conn.D）顯著降低，而結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（SMI）升高，表現(xiàn)出典型OP病理特征。ECH處理顯著改善BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Conn.D，并降低SMI。然而，Hsc70過(guò)表達(dá)消除了ECH的這些治療作用。

骨特異性堿性磷酸酶（BALP）和Ⅰ型前膠原N端前肽（PINP）是典型骨形成生物標(biāo)志物，而Ⅰ型膠原C端交聯(lián)肽（CTX-1）是骨吸收生物標(biāo)志物。進(jìn)一步結(jié)果顯示，OVX組血清PINP降低，而B(niǎo)ALP和CTX-1升高。ECH可逆轉(zhuǎn)這些變化，但Hsc70過(guò)表達(dá)阻斷了ECH介導(dǎo)的PINP、BALP和CTX-1水平恢復(fù)。H&E染色和TRAP染色顯示，ECH改善骨微結(jié)構(gòu)并抑制破骨細(xì)胞生成，而Hsc70過(guò)表達(dá)抵消了ECH對(duì)TRAP陽(yáng)性破骨細(xì)胞的抑制作用。值得注意的是，單獨(dú)Hsc70過(guò)表達(dá)即可在正常大鼠中誘導(dǎo)骨丟失。綜上，這些數(shù)據(jù)表明，ECH通過(guò)靶向HSC70緩解OVX大鼠模型中的OP。

Hsc70敲低緩解卵巢切除大鼠模型中的OP

為探討Hsc70沉默對(duì)骨表型及ECH體內(nèi)治療作用的影響，我們建立了OVX誘導(dǎo)的OP大鼠模型和Hsc70敲低OVX大鼠模型，并通過(guò)灌胃給予ECH處理10周。AAV9介導(dǎo)的Hsc70敲低通過(guò)大鼠膝關(guān)節(jié)腔注射實(shí)現(xiàn)。體重結(jié)果顯示，與NC shRNA+OVX組相比，Hsc70 shRNA+OVX組大鼠體重顯著降低，提示Hsc70敲低減輕了OVX誘導(dǎo)的大鼠體重增加。此外，Hsc70 shRNA+OVX組與Hsc70 shRNA+OVX+ECH組之間體重?zé)o顯著差異，說(shuō)明Hsc70敲低消除了ECH對(duì)大鼠體重的影響。

Micro-CT分析顯示，與NC shRNA+OVX組相比，Hsc70 shRNA+OVX組的BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Conn.D顯著升高，而骨小梁分離度（Tb.Sp）降低，表明Hsc70敲低可緩解OVX誘導(dǎo)的骨丟失和OP表型。然而，Hsc70敲低完全抵消了ECH在OVX大鼠中的治療作用。H&E染色和TRAP染色顯示，Hsc70敲低改善骨微結(jié)構(gòu)并抑制破骨細(xì)胞生成。同時(shí)，Hsc70敲低破壞了ECH對(duì)骨微結(jié)構(gòu)的有益作用及其對(duì)破骨細(xì)胞生成的抑制作用。綜上，這些結(jié)果表明，Hsc70敲低可顯著減輕OVX大鼠的骨丟失。

圖1. HSC70是ECH的細(xì)胞靶點(diǎn)。
（A）松果菊苷（ECH）的化學(xué)結(jié)構(gòu)。（B）ECH處理48 h和72 h后對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力的影響，n=4。（C-D）RANKL刺激的RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)ECH處理7天后的TRAP染色圖像及破骨細(xì)胞生成定量分析。比例尺，500 μm；n=3。（E-H）qRT-PCR分析RANKL刺激的RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)ECH處理72 h后Nfatc1、Ctsk、c-Fos和Acp5的mRNA水平，n=3。（I-J）RANKL刺激的RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)ECH處理7天后的F-actin染色圖像及F-actin環(huán)定量分析。比例尺，200 μm；n=3。（K-L）RANKL刺激的RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)ECH處理10天后的骨吸收陷窩圖像及陷窩面積定量分析。比例尺，200 μm；n=3。（M）ECH pull-down實(shí)驗(yàn)的代表性凝膠圖像，n=3。（N）LC-MS/MS在RAW 264.7細(xì)胞中篩選出的前八個(gè)潛在ECH結(jié)合蛋白。（O）Pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ECH與RAW 264.7細(xì)胞中HSC70的結(jié)合，n=3。（P）RMSD分析反映HSC70-ECH復(fù)合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。（Q）RMSF分析顯示HSC70-ECH復(fù)合物的殘基特異性柔性。（R）Rg分析評(píng)估HSC70-ECH復(fù)合物的結(jié)構(gòu)緊密性。（S）模擬過(guò)程中HSC70與ECH之間的氫鍵數(shù)量。（T）MM/PBSA計(jì)算得到的HSC70-ECH復(fù)合物結(jié)合自由能。（U）HSC70-ECH相互作用的殘基能量分解。TDC：總分解貢獻(xiàn)；SDC：側(cè)鏈分解貢獻(xiàn)；BDC：骨架分解貢獻(xiàn)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。***p<0.001，**p<0.01。ns，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2. HSC70的ARG36和ARG272氨基酸被鑒定為ECH的結(jié)合位點(diǎn)。
（A）HSC70突變體-ECH復(fù)合物的RMSD分析。（B）HSC70突變體-ECH復(fù)合物的RMSF分析。（C）HSC70突變體-ECH復(fù)合物的Rg分析。（D）HSC70突變體與ECH之間的氫鍵數(shù)量。（E）HSC70突變體-ECH復(fù)合物的能量分析。（F）HSC70突變體-ECH復(fù)合物的結(jié)合自由能分析。

圖3. HSC70在OP模型和臨床患者樣本中高表達(dá)。
（A-C）通過(guò)qRT-PCR和WB定量檢測(cè)RAW 264.7細(xì)胞破骨細(xì)胞生成過(guò)程中HSC70的表達(dá)，n分別為3和3。（D-E）Sham和OVX大鼠脛骨切片中HSC70免疫組織化學(xué)代表性圖像及定量分析。比例尺，500 μm；n=3。每組定量分析5張圖像。（F）健康對(duì)照（n=1）和OP患者（n=1）股骨切片的H&E染色及HSC70免疫組織化學(xué)代表性圖像。比例尺，5 mm。（G）健康對(duì)照（n=29）和OP患者（n=29）血漿HSC70水平。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。ns，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4. Hsc70敲低抑制破骨細(xì)胞生成。
（A-B）TRAP染色顯示，在RANKL刺激7天后，Hsc70敲低的RAW 264.7細(xì)胞中破骨細(xì)胞形成減少。比例尺，500 μm；n=3。（C-G）qRT-PCR分析RANKL刺激72 h后Hsc70敲低RAW 264.7細(xì)胞中Nfatc1、Ctsk、c-Fos和Acp5的mRNA水平，n=3。（H-I）RANKL刺激7天后Hsc70敲低RAW 264.7細(xì)胞的F-actin染色圖像及F-actin環(huán)定量分析。比例尺，200 μm；n=3。（J-K）RANKL刺激10天后Hsc70敲低RAW 264.7細(xì)胞的骨吸收陷窩圖像及陷窩面積定量分析。比例尺，200 μm；n=3。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

圖5. HSC70通過(guò)IKKβ-NF-κB軸調(diào)控破骨細(xì)胞生成。
（A）WB分析RANKL刺激的RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)ECH處理8 h后核內(nèi)和胞質(zhì)NF-κB p65蛋白水平，n=3。（B）免疫熒光染色及定量分析RANKL刺激的RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)ECH處理8 h后的NF-κB p65核轉(zhuǎn)位。比例尺，25 μm。（C）RANKL刺激8 h后Hsc70敲低RAW 264.7細(xì)胞中核內(nèi)和胞質(zhì)NF-κB p65蛋白水平，n=3。（D）免疫熒光染色及定量分析RANKL刺激8 h后Hsc70敲低RAW 264.7細(xì)胞中的NF-κB p65核轉(zhuǎn)位。比例尺，25 μm。（E）WB分析RANKL刺激的RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)ECH處理8 h后IKKβ和p-IκBα水平，n=3。（F）RANKL刺激8 h后Hsc70敲低RAW 264.7細(xì)胞中IKKβ和p-IκBα蛋白水平，n=3。（G）293T細(xì)胞經(jīng)ECH（20 μM）處理不同時(shí)間后進(jìn)行環(huán)己酰亞胺（CHX，50 μg/ml）追蹤實(shí)驗(yàn)，并通過(guò)WB分析IKKβ蛋白水平，n=3。（H）Hsc70敲低RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)10 μg/ml CHX處理不同時(shí)間后IKKβ降解動(dòng)力學(xué)，通過(guò)WB分析IKKβ蛋白水平，n=3。（I）RAW 264.7細(xì)胞先經(jīng)MG-132處理，再暴露于ECH 8 h，檢測(cè)并定量IKKβ相對(duì)蛋白水平，n=3。（J）293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染Myc-IKKβ和HA-Ub質(zhì)粒48 h后，經(jīng)ECH處理24 h并經(jīng)MG-132處理8 h，進(jìn)行共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。泛素化IKKβ用抗Myc微珠免疫沉淀，并用抗HA抗體檢測(cè)，n=3。（K）293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染Myc-IKKβ和HA-Ub質(zhì)粒24 h后，再轉(zhuǎn)染靶向HSC70的siRNA 48 h，并經(jīng)MG-132處理8 h，進(jìn)行共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。泛素化IKKβ用抗Myc微珠免疫沉淀，并用抗HA抗體檢測(cè)，n=3。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。ns，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖6. ECH靶向HSC70緩解卵巢切除大鼠模型中的OP。
（A）AAV9介導(dǎo)Hsc70遞送及ECH處理OVX大鼠的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。（B）各實(shí)驗(yàn)組大鼠體重監(jiān)測(cè)，n=7/組。（C）各實(shí)驗(yàn)組大鼠股骨代表性micro-CT圖像及三維重建圖，n=5/組。（D-I）基于C圖的骨小梁組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析：BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、SMI和Conn.D，n=5/組。（J-L）各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清PINP、BALP和CTX-1水平，n=6/組。（M）各實(shí)驗(yàn)組大鼠脛骨切片H&E和TRAP染色代表性圖像。黑色箭頭表示TRAP陽(yáng)性細(xì)胞。比例尺分別為200 μm和100 μm；n=3/組。（N）各實(shí)驗(yàn)組大鼠脛骨切片H&E和TRAP染色圖像定量分析。每組定量分析5張圖像。（O-P）各實(shí)驗(yàn)組大鼠脛骨切片HSC70免疫組織化學(xué)代表性圖像及定量分析。比例尺，500 μm；n=3/組。每組定量分析5張圖像。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。ns，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖7. Hsc70過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)正常大鼠骨丟失。
（A）AAV9介導(dǎo)Hsc70過(guò)表達(dá)與空載體（AAV9-Vector）在大鼠中的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。（B）對(duì)照組（Vector）和Hsc70過(guò)表達(dá)組股骨代表性micro-CT圖像及三維重建圖，n=3/組。（C-H）基于B圖的骨小梁組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析：BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp和SMI，n=3/組。（I）AAV9-Vector組和AAV9-Hsc70組大鼠脛骨切片H&E和TRAP染色代表性圖像。黑色箭頭表示TRAP陽(yáng)性細(xì)胞。比例尺分別為200 μm和100 μm；n=3/組。（J）AAV9-Vector組和AAV9-Hsc70組大鼠脛骨切片H&E和TRAP染色圖像定量分析。每組定量分析5張圖像。（K-L）AAV9-Vector組和AAV9-Hsc70組大鼠脛骨切片HSC70免疫組織化學(xué)代表性圖像及定量分析。比例尺，500 μm；n=3/組。每組定量分析5張圖像。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

圖8. Hsc70敲低緩解卵巢切除大鼠模型中的OP。
（A）AAV9介導(dǎo)Hsc70 shRNA遞送及ECH處理OVX大鼠的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。（B）各實(shí)驗(yàn)組大鼠體重監(jiān)測(cè)，n=7/組。（C）各實(shí)驗(yàn)組大鼠股骨代表性micro-CT圖像及三維重建圖，n=5/組。（D）基于C圖的骨小梁組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析：BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp和Conn.D，n=5/組。（E）各實(shí)驗(yàn)組大鼠脛骨切片H&E和TRAP染色代表性圖像。黑色箭頭表示TRAP陽(yáng)性細(xì)胞。比例尺分別為200 μm和100 μm；n=5/組。（F）各實(shí)驗(yàn)組大鼠脛骨切片H&E和TRAP染色圖像定量分析。每組定量分析5張圖像。（G-H）各實(shí)驗(yàn)組大鼠脛骨切片HSC70免疫組織化學(xué)代表性圖像及定量分析。比例尺，500 μm；n=5/組。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。ns，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖9. ECH通過(guò)抑制HSC70介導(dǎo)破骨細(xì)胞生成的機(jī)制示意圖。

【Citation】:Han D, Wu QT, Wang L, Li JG, Li P, Li F. Echinacoside targets HSC70 to inhibit osteoclastogenesis and ameliorate ovariectomy-induced osteoporosis.Phytomedicine. Published online April 10,2026.

【貢獻(xiàn)】★★★★★

綜上，本研究鑒定HSC70為ECH的直接細(xì)胞靶點(diǎn)。值得注意的是，HSC70在OP中病理性上調(diào)，并通過(guò)調(diào)控IKKβ的泛素化介導(dǎo)降解正向調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成。此外，ECH靶向HSC70可在體內(nèi)有效減輕骨丟失。總體而言，這些發(fā)現(xiàn)為OP提供了潛在治療靶點(diǎn)，并鑒定ECH是一種新的HSC70抑制劑，在OP治療中具有重要轉(zhuǎn)化潛力。

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