瑞香素——緩解椎間盤退變的新希望

腰痛影響著全球數(shù)億人的生活質(zhì)量，也是導(dǎo)致殘疾的最主要原因之一。椎間盤退變是腰痛的核心病理基礎(chǔ)，而炎癥反應(yīng)在退變過程中扮演著關(guān)鍵角色。然而，目前臨床上尚缺乏能夠有效延緩或逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的藥物。

2024年1月，Nature Communications發(fā)表了一項重磅研究。研究者通過單細(xì)胞RNA測序技術(shù)，首次繪制了人類髓核細(xì)胞的精細(xì)圖譜，發(fā)現(xiàn)了一群“晚期髓核細(xì)胞”，其高表達(dá)的Serglycin是促進炎癥和退變的關(guān)鍵分子。更令人振奮的是，天然產(chǎn)物瑞香素能夠與Serglycin結(jié)合、下調(diào)其表達(dá)，在小鼠體內(nèi)顯著緩解椎間盤退變。

一、研究背景

椎間盤由中央的髓核、周圍的纖維環(huán)和上下軟骨終板構(gòu)成。髓核細(xì)胞是維持椎間盤功能的核心細(xì)胞。隨著年齡增長或長期異常應(yīng)力，髓核細(xì)胞會發(fā)生表型改變，局部炎癥因子升高，巨噬細(xì)胞浸潤，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解、椎間盤結(jié)構(gòu)破壞。

Serglycin是一種細(xì)胞內(nèi)糖蛋白，參與炎癥因子和趨化因子的儲存與釋放。既往研究發(fā)現(xiàn)其在多種炎癥性疾病和腫瘤中上調(diào)，但在椎間盤退變中的作用尚不明確。瑞香素是一種天然香豆素衍生物，已知具有抗炎、抗凋亡等活性，但其對椎間盤退變的影響此前未見報道。

二、研究目的

本研究旨在：①通過單細(xì)胞RNA測序構(gòu)建人類髓核細(xì)胞圖譜，鑒定出與退變密切相關(guān)的髓核細(xì)胞亞群；②探索該亞群的關(guān)鍵分子Serglycin在椎間盤退變中的作用機制；③驗證瑞香素能否通過靶向Serglycin緩解椎間盤退變。

三、研究方法

本研究以7例接受椎間盤切除術(shù)患者的髓核組織（輕度退變4例、重度退變3例，年齡41.14±18.01歲）為主要樣本來源，并另收集48例椎間盤樣本用于驗證。采用10X Genomics平臺對55 264個細(xì)胞進行單細(xì)胞RNA測序，通過無監(jiān)督聚類和標(biāo)記基因鑒定細(xì)胞亞群。

檢測指標(biāo)涵蓋影像學(xué)、組織病理、蛋白表達(dá)、分子機制以及細(xì)胞實驗。統(tǒng)計方法采用t檢驗、方差分析（Bonferroni校正）或Kruskal-Wallis H檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

四、研究結(jié)果

1.單細(xì)胞圖譜鑒定出6個髓核細(xì)胞亞群，其中“纖維化髓核細(xì)胞”是晚期退變的關(guān)鍵群體

研究者對55 264個細(xì)胞進行聚類，偽時間軌跡分析顯示，前體髓核細(xì)胞位于分化起點，而纖維化髓核細(xì)胞位于終點，主要分布在重度退變組織中，因此被定義為晚期髓核細(xì)胞。基因本體分析表明，該亞群參與膠原纖維和細(xì)胞外基質(zhì)組織。

2.晚期髓核細(xì)胞高表達(dá)Serglycin，且與退變程度正相關(guān)

單細(xì)胞測序顯示，重度退變組中Serglycin的表達(dá)顯著升高，尤其在晚期髓核細(xì)胞中。RNA-seq驗證了該結(jié)果，且Serglycin與椎間盤退變標(biāo)志物呈正相關(guān)。聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，Serglycin是9個共同上調(diào)基因之一。

3.敲除Serglycin顯著緩解小鼠椎間盤退變

研究者構(gòu)建了Srgn-/-小鼠，并進行纖維環(huán)穿刺造模。術(shù)后8周，MRI顯示：野生型+穿刺組T2信號明顯降低（退變加重），而Srgn-/-+穿刺組T2信號強度明顯高于野生型+穿刺組（退變減輕）。顯微CT和椎間盤高度測量也證實，敲除Serglycin保護了椎間盤高度。

組織學(xué)染色（H&E、番紅-O、天狼星紅）顯示：Srgn-/-+穿刺組髓核組織保留更多，組織學(xué)評分更低。免疫組化顯示：敲除Serglycin后，COL2A1和ACAN（基質(zhì)合成蛋白）陽性細(xì)胞比例升高，而COL1A1（退變相關(guān)膠原）陽性細(xì)胞比例降低。免疫熒光結(jié)果一致。

4.Serglycin通過激活NF-κB通路促進炎癥因子分泌

偽時間動態(tài)分析顯示，晚期髓核細(xì)胞中IL1B、TNF和CCL3表達(dá)上調(diào)。炎癥因子陣列定量證實，退變模型和重組Serglycin處理均可顯著升高多種炎癥因子。

在人體髓核細(xì)胞中，敲低Serglycin可顯著降低IL-1β、TNF-α和CCL3的表達(dá)。機制探索發(fā)現(xiàn)，Serglycin處理可顯著增加p-P65（NF-κB活化標(biāo)志）水平，而敲低P65可阻斷Serglycin誘導(dǎo)的炎癥因子升高。這表明Serglycin通過激活NF-κB通路促進炎癥。

5.晚期髓核細(xì)胞分泌的Serglycin促進巨噬細(xì)胞浸潤和M1極化

單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，重度退變組織中存在一群TNF?巨噬細(xì)胞，具有M1表型（CD11c?CD86?）。CellPhoneDB分析顯示，晚期髓核細(xì)胞與TNF?巨噬細(xì)胞之間存在配體-受體對（包括CCL3及其受體）。

Transwell遷移實驗表明：重組Serglycin處理的髓核細(xì)胞上清可顯著促進RAW264.7巨噬細(xì)胞遷移，而敲低Serglycin或P65則抑制遷移。流式細(xì)胞術(shù)證實，Serglycin增加M1型巨噬細(xì)胞（CD11c?CD86?）比例，而敲低P65可逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)。

在小鼠模型中，Srgn-/-+穿刺組的F4/80（巨噬細(xì)胞）和CD86（M1標(biāo)志）雙陽性細(xì)胞顯著少于野生型+穿刺組，說明Serglycin促進巨噬細(xì)胞浸潤和M1極化。

6.瑞香素與Serglycin結(jié)合，下調(diào)其表達(dá)并緩解椎間盤退變

研究者使用AlphaFold2預(yù)測Serglycin蛋白結(jié)構(gòu)，分子對接顯示瑞香素與Serglycin具有良好結(jié)合能力（RMSD=0.406，結(jié)合能=-15.313 kJ/mol）。細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移分析證實瑞香素在細(xì)胞內(nèi)與Serglycin結(jié)合。

體外實驗：瑞香素（2 μM）處理可顯著降低饑餓誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞中Serglycin的表達(dá)。炎癥因子陣列和Western blot顯示，瑞香素可抑制重組Serglycin誘導(dǎo)的TNF、CCL3、IL-1β以及p-P65升高。功能上，瑞香素處理可減少巨噬細(xì)胞遷移，并降低M1極化比例。

五、結(jié)論

瑞香素通過下調(diào)SRGN的表達(dá)，減少炎性細(xì)胞因子的分泌并抑制巨噬細(xì)胞的浸潤，從而有效延緩椎間盤退變的進展。目前，瑞香素已被成功合成并納入臨床用藥，用于治療血栓閉塞性脈管炎及其他閉塞性血管疾病。基于其抑制SRGN表達(dá)、減輕椎間盤局部炎癥反應(yīng)的能力，瑞香素有望成為治療椎間盤退變的一種有效策略。

參考文獻

Chen F，Lei L，Chen S，et al.Serglycin secreted by late-stage nucleus pulposus cells is a biomarker of intervertebral disc degeneration[J].Nat Commun，2024，15（1）：47.