Angew?ChemInt?Edit丨周佳海/古陽團隊利用輕量化機器學習方法加速光酶進化實現含氟化合物的高效不對稱合成

含氟化合物是醫藥、 農業 和材料領域的關鍵結構單元 ，然而 在溫和條件下實現 偕 二氟 基團 的高選擇性 、 可持續 引入仍 是一大挑戰。近年來，光酶催化融合了光催化和生物催化的優勢，為不對稱合成提供了強有力的平臺， 其中 黃素單核苷酸（ FMN ）依賴 型 “ 烯 ” 還原酶（ EREDs ） 備受關注 。酶在長期的自然進化中形成了固有的底物特異性，直接用于非天然轉化時效率較低。傳統的定向進化方法 通常 需篩選 數 千 至 上萬 個 突變體， 耗 時費力；而基于蛋白質語言模型（ PLMs ）的 “ 零樣本 ” 預測在面對非天然自由基反應時，往往因缺乏特定的訓練數據，難以準確建立序列與催化活性 / 選擇性 之間的映射 關系 。

針對 上述 挑戰，中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所客座研究員 / 南京師范大學教授周佳海與 團隊副研究員古陽等 提出了一種將活性口袋理性設計與機器學習模型相結合的小樣本、 加速 進化策略， 該成果以Machine-Learning-Enabled Rapid Evolution ofPhotoenzymesfor the Asymmetric Synthesis ofgem-Difluorophosphonates為題，作為 VIP 論文發表于 《德國應用化學》（ Angewandte Chemie International Edition ）。研究團隊通過結構導向的熱點識別與主動學習，僅在三輪進化中篩選了40個突變體，便成功獲得了兼具高活性和高對映選擇性的光酶突變株，整體工作量較窮舉篩選減少了65%。該工作為非天然光酶催化體系的高效開發提供了一種“輕量級”的機器學習框架。

破局：光酶催化“馴服”高活性烷基自由基反應

烷基自由基因活性高、壽命短，如何“駕馭”其可控、定向、非對稱合成，一直是有機催化領域的難題 。研究團隊以 溴二氟甲基膦 酸二乙酯 為自由基前體、 α- 甲基苯乙烯為 自由基受體，首先開展了 反應體系 的 構建。在初步篩選中，來自 Gluconobacter 的 “ 烯 ” 還原酶（ GluER ）突變體 T36A 展現出獨特潛力 —— 盡管初始產率僅為 5% ， 卻 表現出極高的對映選擇性（ 94:6 e.r . ）。為進一步提升反應效率， 團隊 系統優化了反應參數 ，成功將野生型酶 的產率由 5 % 提升至 58% ，且選擇性保持優異。控制實驗 表明 ：酶、 NADPH 再生系統、光照和厭氧環境對于反應的發生缺一不可。

圖 1. 反應設計及 初始酶庫篩選

創新：從傳統定向進化到AI指導設計

為進一步突破產率和選擇性瓶頸，研究團隊 開發 了 AI 指導的智能文庫 設計方法 。他們通過 AutoDock Vina 構建 了底物、輔因子與酶的四元復合物結構，將距離底物和輔因子 5? 范圍內的 38 個氨基酸殘基 作 為潛在突變位點。隨后，采用聚焦理性迭代位點特異性誘變（ FRISM ）策略，將這些位點分別突變為空間位阻不同的三種氨基酸（ A 、 L 、 F ），構建了一個包含 114 個候選突變體的精簡 “ 智能文庫 ” 。利用 蛋白質 大語言模型 ESM2 對序列進行特征嵌入，并改進了 EVOLVEpro 模型，通過對產率和對映選擇性進行加權復合評分， 協同 指導主動學習。

圖 2 . AI 指導的 FRISM 策略 加速 光酶定向進化

高維的 ESM2 嵌入特征需要匹配合適的頂層模型 ， 才能將從進化信息中提取的適應性景觀 （ fitness landscape ） 微調至特定的活性 / 選擇性景觀（ activity/selectivity landscape ）。研究團隊利用基線數據集 對比了 9 種機器學習算法， 確定 隨機森林（ Random Forest ）為最穩健的 頂端 預測器。在隨后的 3 輪迭代進化中，模型僅推薦并測試了 40 個突變體，便鎖定了 4 個關鍵單突變。通過進一步的 雙位點組合突變 ，成功挖掘出兩個性能卓越的組合突變體： ER1 實現了 幾乎完全轉化 的產率（ 95% yield, 95:5 e.r . ） ； ER2 實現了最優的 對映選擇性（ 75% yield, 97:3 e.r . ）。

應用：含氟磷酸酯類化合物的高效、高選擇性合成

獲得了 最優反應條件及 突變體 ER1 和 ER2 后，研究團隊對其底物適用范圍進行了廣泛拓展。結果表明：

• 該光酶體系 對各類帶有 給電子基 或 吸電子基 的間位、對位取代苯乙烯衍生物表現出良好的耐受性。

• 雜環底物以及具有大位阻的復雜底物均能以最高 >99% 的產率和 98:2 e.r . 高效轉化為 相應 的含氟目標產物。

• 分子對接表明： ER1 的高產率源于更高效的底物 裝載 和更便利的氫原子轉移過程；而 ER2 的高選擇性則受活性口袋內 F269 殘基明顯的空間位阻效應驅動。

此外，在制備級的 1 mmol 放大實驗中， ER1 依然能以 88% 的 分離收率催化 得到 目標 產物，且該產物可 高效 水解為生物活性分子設計中常見的 膦 酸結構單元，彰顯了極高的合成應用價值。

機理：光酶催化自由基發生、加成與發散性氫原子轉移

為了闡明光酶催化的深層機理，研究團隊開展了系列機制探究。研究表明，該循環起始于 GDH 介 導的氫負離子轉移，將氧 化態黃 素 FMN ox 還原為氫醌態 FMN hq ；伴隨著自由基前體擴散進入酶活性口袋空腔，可見光激發的 FMN hq * 單電子還原自由基前體并促使 溴 負離子離去 產生二氟甲基 自由基；高活性 的二氟甲基 自由基會快速加成到附近的不飽和烯烴上，產生較穩定的芐基自由基中間體；該芐基自由基中間體 會從酶口袋 輔因子或活性氨基酸中攫取一個氫原子以得到最終特定構型的產物。

一系列機理實驗揭示了該過程的關鍵細節：

1. 無 EDA 復合物形成：紫外 - 可見光 光 譜（ UV-Vis ）證實反應體系中不存在底物與酶 / 輔因子 之間的電荷轉移復合物，表明自由基前體的還原 直接 由蛋白質骨架內光激發的黃素氫醌態 FMN hq * 通過單電子轉移驅動。

2. 自由基中間體驗證：自由基鐘實驗使用 α- 環丙基苯乙烯作為探針，成功捕捉到開環產物，證實了反應中瞬態芐基自由基中間體 的存在 。

3. 氫原子轉移路徑：同位素標記實驗揭示了令人驚奇的現象 —— 在 ER1 中，芐基自由基主要通過黃素半醌態 FMN sq 的 N5H 氫原子 轉移 終止；而在 ER2 中， 底物結合 構象改變 使得 FMN sq 氫原子 轉移 在空間上不可行 ， 芐基 自由基轉而從活性口袋內的關鍵殘基 Y343 上 攫取 氫原子。

有趣的是，當在 ER2 中引入 Y343F 突變關閉 自由基淬滅 路徑 后 ，反應的產率和選擇性大幅 降低 ，并伴隨大量 去飽和 烯烴副產物的生成。這一意外的發現表明 FMN sq 具有將自由基中間體氧化為碳正離子的潛力，為未來開發新型自由基 介 導的烯烴構建反應提供了全新思路。

圖 3 . 光酶催化循環與自由基淬滅機制探究

總結與展望

總體而言，本研究 開發了一種 AI 指導的 FRISM 策略，顯著提升了非天然轉化中 光酶 改造 的進化效率 。通過將結構熱點識別與 蛋白質大語言模型 表征、主動學習相結合，實現了產率與選擇性的雙重同步優化，僅測試 40 個突變體便 得到最優突變位點， 將實驗工作量削減了 65% 。這一策略成功 克服了 高活性烷基自由基 加成的不對稱控制難題，為綠色合成高價值有機 含 氟化合物開辟了新途徑，也極大地促進了人工智能與生物催化領域的深度融合 。

中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所客座研究員 / 南京師范大學教授 周佳海 及 其團隊 副研究員 古陽 為本文共同通訊作者，課題組博 士生 王 鴻 奎 為本文第一作者，中國科學院深圳先進技術研究院 與 福建農林大學 聯 培 碩士生 許嘉 凡 為本工作做出了重要貢獻。中國科學院深圳先進技術研究院為本文 第一 完成單位。

原文鏈接：https://doi.org/10.1002/anie.1402106

制版人： 十一

學術合作組織

（*排名不分先后）

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