剛剛，諾獎得主Doudna再發(fā)Science：AI設(shè)計蛋白質(zhì)，超越自然演化！

諾獎得主 Jennifer Doudna 團隊，再發(fā)頂刊 Science。

他們實現(xiàn)了“超越自然演化”的 AI 蛋白質(zhì)設(shè)計，創(chuàng)造出的新型基因編輯蛋白 SynTnpB 部分變體活性達到甚至超過了天然酶。

論文鏈接：http://www.science.org/doi/10.1126/science.aed6123

冷凍電鏡結(jié)果進一步揭示，這些工程化蛋白質(zhì)在不同構(gòu)象下于 RNA-DNA 界面形成了新的穩(wěn)定相互作用。這也是首次通過實驗確定 AI 設(shè)計的 RNA 引導(dǎo)核酸酶的結(jié)構(gòu)。

研究團隊表示，結(jié)合生成式生物學(xué)和從頭設(shè)計方法，未來有望突破自然序列界限，擴展這類蛋白的功能和可設(shè)計空間。

超越自然的AI蛋白質(zhì)設(shè)計

目前，CRISPR-Cas 技術(shù)已能精準(zhǔn)編輯 DNA/RNA，但要設(shè)計出自然界不存在、且仍有活性的 RNA 引導(dǎo)核酸酶，絕非易事。現(xiàn)有序列模型生成的酶往往接近天然序列；結(jié)構(gòu)引導(dǎo)設(shè)計雖能探索更大序列空間，卻仍難在大幅改寫序列的同時保留活性。

不同于此前基于序列的生物語言模型，Doudna 團隊提出了一種結(jié)合結(jié)構(gòu)與進化信息的 AI 蛋白設(shè)計策略，用于生成序列高度分化、但仍保留活性的 RNA 引導(dǎo)核酸酶。

為驗證這一策略，他們選擇小型 RNA 引導(dǎo)核酸酶 TnpB 作為設(shè)計對象。具體流程如下：

1.設(shè)計模塊：生成新的 TnpB 序列

他們先采用ESM 逆折疊模型（ESM-IF1）根據(jù) TnpB 三維結(jié)構(gòu)生成候選序列。AI 生成的序列能保留 TnpB 的整體折疊和 RuvC 結(jié)構(gòu)域的 DED 催化三聯(lián)體，但也會改動部分 RNA/DNA 識別殘基。

針對這一問題，他們基于進化信息構(gòu)建序列掩碼：位置保守性（Ci）或與核酸序列的共同進化耦合強度（σi）高于設(shè)定閾值的殘基被固定為野生型，其余位置則交由 ESM-IF1 重新設(shè)計。

圖｜使用 ESM Inverse Folding（ESM-IF1）模型進行 RNA 引導(dǎo)核酸酶 TnpB 設(shè)計的策略。

2.篩選模塊：鑒定具有活性的變體

完成序列設(shè)計后，他們用細菌 ccdB 毒素系統(tǒng)篩選活性變體：能切割毒素質(zhì)粒的 TnpB 變體可使細菌存活。由于僅用 Ci 約束的全長設(shè)計活性有限，他們拆分測試了 TnpB 的兩個結(jié)構(gòu)域：REC 主要參與 DNA 識別，NUC 與 RNA 結(jié)合和催化相關(guān)。結(jié)果顯示，NUC 更耐受序列變化。基于此，他們采用 Ci/σi 雙條件約束組合在 1980 個 REC-NUC 組合中篩出 9 個高活性、高多樣性的變體。

圖｜篩選基于位置保守性（Ci）和耦合強度（σi）閾值條件化生成的 AI 變體SynTnpB。

活性超越天然酶

整體來看，AI 設(shè)計的 SynTnpB 變體在細菌、植物和人類細胞中保留了活性，甚至超過天然酶。冷凍電鏡結(jié)構(gòu)進一步顯示，這些 AI 設(shè)計變體能在不同構(gòu)象狀態(tài)下穩(wěn)定 RNA-DNA 界面。具體結(jié)果如下：

1.人類和植物細胞編輯

篩選得到的變體在人類和植物細胞中均保留編輯活性，部分超過天然酶。他們將 9個變體放入 HEK293T 細胞和擬南芥原生質(zhì)體驗證。在人類細胞中，多數(shù)變體活性與野生型相當(dāng)，v1 和 v5 表現(xiàn)最佳，最高編輯率達到 50%，約為野生型的 1.8 倍。植物細胞實驗中，v1 同樣在多數(shù)測試靶點上優(yōu)于野生型。

圖｜AI 生成的 TnpB 在 HEK293T 細胞中的基因組編輯。

2.特異性和生化表征

從特異性來看，SynTnpB 變體保留了典型 TTGAT TAM 偏好，但脫靶表現(xiàn)因變體而異。全基因組 Tn5 標(biāo)簽化分析顯示，v1 的特異性與野生型相當(dāng)，v5 和 v7 檢測到更多脫靶位點。

從表達和生化表征來看，編輯活性差異不能簡單歸因于表達水平。Western blot 結(jié)果顯示，各變體表達水平與編輯活性不相關(guān)。以 v7 變體為例，其熱穩(wěn)定性與野生型相當(dāng)，并保留較強的靶鏈切割活性，但切割反應(yīng)較野生型有所減慢。

3.冷凍電鏡結(jié)構(gòu)

結(jié)果顯示，AI 生成的殘基在多個結(jié)構(gòu)域與 RNA-DNA 形成新接觸，穩(wěn)定不同構(gòu)象狀態(tài)下的界面。此外，他們還捕獲到此前未在 TnpB 中報道過的 TAM 結(jié)合構(gòu)象中間態(tài)。

他們選擇序列分化程度較高的 v7 進行冷凍電鏡解析。該變體與野生型序列一致性為77%，并在 RUNX1 位點顯示較高編輯效率。實驗顯示，冷凍電鏡結(jié)構(gòu)分辨率達到 2.8 ?，并捕獲到 TAM 結(jié)合狀態(tài)和 R-loop 形成狀態(tài)兩種構(gòu)象。

TAM 結(jié)合狀態(tài)中，蛋白和 RNA 構(gòu)象與 ISDra2 TnpB 二元復(fù)合物相似，同時結(jié)合了 DNA，并在異源雙鏈種子區(qū)形成單堿基配對。AI 生成的 N4R 殘基與保守的“磷酸鎖”殘基 K84 共同穩(wěn)定這一配對。該構(gòu)象中間體此前未在 TnpB 中觀察到。

R-loop形成狀態(tài)中，reRNA 和靶 DNA 已經(jīng)形成較完整的配對結(jié)構(gòu)。此時，AI 生成的殘基分布在 REC、NUC 和 lid 等區(qū)域，與這段 RNA-DNA 雙鏈形成接觸；同時，橋接螺旋仍保留有助于雙鏈形成的彎折運動。

圖｜AI 生成變體 v7 的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)揭示了 RNA-DNA 界面殘基和保守的構(gòu)象運動。

不足和未來發(fā)展

不過，他們也表示，雖然當(dāng)前方法有望推廣到更多 RNA 引導(dǎo)核酸酶及其他動態(tài)核酸結(jié)合蛋白，但有幾點不足。

例如，在設(shè)計目標(biāo)方面，TnpB 不同結(jié)構(gòu)域?qū)π蛄懈淖兊哪褪苄圆⒉幌嗤珼NA 識別相關(guān)的 REC 結(jié)構(gòu)域?qū)μ鎿Q更敏感，而 RNA 結(jié)合和催化相關(guān)的 NUC 結(jié)構(gòu)域更能耐受變化。未來，他們?nèi)孕柽M一步檢驗?zāi)K化設(shè)計原則是否適用于其他多結(jié)構(gòu)域蛋白。

同時，在數(shù)據(jù)條件方面，序列掩碼依賴足夠豐富的進化信息，對數(shù)據(jù)庫中序列的多樣性和代表性要求較高。更豐富、更均衡的蛋白-核酸配對數(shù)據(jù)，有助于將這一方法推廣到其他多狀態(tài)蛋白或核酸結(jié)合蛋白。

此外，在機制理解方面，AI 生成殘基如何影響核酸結(jié)合和構(gòu)象變化，仍需要進一步研究。他們表示，該研究的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)捕獲到此前未報道的 TAM 結(jié)合狀態(tài)，可能代表一種動力學(xué)中間體，也為未來研究 RNA 引導(dǎo)核酸酶的瞬時構(gòu)象提供了先例。

更多技術(shù)細節(jié)，詳見原論文。

作者：夏千斯

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