體內CAR-T療法成功之路：病毒與非病毒載體的比較

引言

CAR-T細胞療法通過引入能夠識別并結合靶抗原的合成受體，重定向T淋巴細胞以識別并清除腫瘤細胞。抗原結合后，CAR-T細胞釋放穿孔素和顆粒酶等細胞毒性分子，誘導惡性細胞凋亡。盡管取得了成功，但多重障礙仍然限制了CAR-T療法的更廣泛影響。全身性毒性，包括細胞因子釋放綜合征（CRS）和免疫效應細胞相關神經毒性綜合征（ICANS），可能危及生命。由于免疫抑制性腫瘤微環境、異質性抗原表達以及T細胞在實體瘤中的浸潤不良，在血液惡性腫瘤之外的臨床療效有限。

從制造角度看，離體CAR-T生產復雜、勞動密集且成本高昂。該過程通常需要患者特異性T細胞采集、分離、激活、基因修飾、擴增和制劑。這些制造瓶頸導致了高昂的治療成本并限制了患者的可及性。盡管異體方法可能降低成本，但其長期療效尚未得到證實，如高復發率所示。此外，移植物抗宿主病（GvHD）和免疫排斥的風險仍然存在。

體內CAR-T療法代表了一種范式轉變，旨在通過將CAR轉基因直接遞送至患者T細胞來繞過離體制造。如果成功，這種方法可以開發出一種與異體CAR-T相比免疫原性降低的“現貨型”產品，同時降低與自體制造相關的失敗率。通過消除對患者來源細胞的需求，這種模式可能會降低自體離體CAR-T中觀察到的制造失敗率。

一、病毒載體

病毒載體在治療中的應用已被探索數十年，理解其結構和機制的進展加速了病毒基因遞送的發展。目前有多種病毒系統可用，提供不同的特性，包括穩定或瞬時表達、可變的包裝容量、多樣的組織嗜性以及不同的安全性特征。這些載體通常包含三個組件：（1）目標轉基因；（2）決定細胞或組織嗜性的衣殼或包膜蛋白；（3）控制穩定或瞬時基因表達的調控盒。LV、腺相關病毒（AAV）和腺病毒（AdV）載體均已獲準用于臨床。

慢病毒載體（LV）

LV已經歷了四代發展，每一代都旨在通過修改基因構建體、保留或去除野生型基因以及整合異源元件來提高載體產量和生物安全性。其中，第三代系統因其在安全性和高效生產之間取得平衡，仍是臨床應用最廣泛的選擇。基于LV的離體療法已取得臨床成功，包括用于癌癥的CAR-T產品和用于多種遺傳病的造血干細胞療法。

LV是具有脂質包膜的顆粒，包裝約80-100 nm的單鏈RNA基因組，容量約為8.5 kb。轉導通過受體介導的內吞作用發生，其中包膜糖蛋白與細胞表面受體結合，實現融合和進入。RNA被逆轉錄、轉運至細胞核并整合到宿主基因組中。它們穩定表達轉基因以及轉導分裂和非分裂細胞的能力，使LV成為一種多功能載體。大多數LV使用水皰性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）進行假型化，這賦予了其穩定性和高滴度。然而，VSV-G的廣泛嗜性引起了對其體內使用的擔憂，因為它可能導致脫靶轉導。

臨床前研究已開始測試LV用于體內CAR-T生成，證明了腫瘤消退和癌細胞耗竭，但插入突變風險和嗜性特異性不足仍然是重大障礙。最近采用第四代LV平臺的工作，結合先進的重新靶向包膜蛋白和最小化異常剪接的基因組設計，實現了高效、T細胞特異性的體內CAR-T生成。非人類靈長類動物研究表明，CAR-T細胞可持續數月持久存在，且無需傳統的淋巴細胞耗竭化療，支持了基于LV的體內產品的轉化潛力。

腺相關病毒載體（AAV）

AAV載體是無包膜的，由一個包含單鏈DNA基因組的蛋白質衣殼組成。其嗜性取決于血清型。選擇合適的血清型對于實現靶向CAR基因遞送和最小化脫靶效應至關重要。AAV體積小（約25 nm），缺乏脂質包膜，包裝容量約為4-6 kb，具體取決于血清型。細胞表面結合后，通過網格蛋白介導的內吞作用進入，載體被轉運至細胞核，轉基因以染色體外狀態持久存在。與LV不同，AAV基本上是非整合性的，但已在約0.1%的轉染細胞中檢測到整合事件。

良好的安全性、高轉導效率和多功能靶向性使AAV成為體內基因治療的領先平臺。已批準的基于AAV的療法包括治療視網膜疾病、血友病B、遺傳性視網膜營養不良和脊髓性肌萎縮癥的產品。體內CAR-T應用也已得到研究，單個AAV輸注在人類化腫瘤小鼠模型中遞送CAR轉基因，產生了穩健的CAR-T生成和腫瘤消退。然而，這些研究尚未完全表征脫靶轉導，并且尚未發現具有排他性T細胞嗜性的AAV血清型，這使得衣殼進化（例如Ark313）和衣殼結合的靶向配體成為活躍的研究領域。

腺病毒載體（AdV）

與AAV相比，人腺病毒（HAdV）載體（90-100 nm）以非整合方式遞送基因，將轉基因維持在附加體和染色體外。其主要優勢是包裝容量，使用高容量載體（HCAdV）時可達37 kb。這使得能夠整合自殺基因、細胞類型特異性調控元件和基因反饋回路，這些特征可能增強體內應用的療效。

已鑒定出超過57種HAdV血清型，每種都具有不同的表面化學和介導進入的受體。HAdV-C5是研究最廣泛的之一。進入是通過與柯薩奇病毒和腺病毒受體及整合素的相互作用發生的，這兩者都不在人T細胞上表達。為了解決這個問題，工程化的Ad5/35載體實現了在預激活T細胞中近20%的轉導效率，而未修飾的毒株則低于2%。然而，由于CD46在所有有核人細胞上表達，這種策略缺乏選擇性。使用針對T細胞更特異性標志物（CD3、CD28和IL-2受體）的適配子進行進一步優化，在預激活T細胞中達到了7.6%的轉導率。

雖然通常被認為是安全的，但HAdV載體可以觸發不必要的免疫反應，中和抗體可能降低療效。針對這些限制的策略正在開發中。

二、非病毒載體

非病毒載體包括多種遞送系統，包括納米顆粒、脂質體和聚合物，旨在將治療性載荷運送到靶細胞中。它們通常因較低的免疫原性和細胞毒性而優于病毒方法。病毒載體一個長期存在的擔憂是插入突變，其中整合可能破壞腫瘤抑制基因或激活癌基因，潛在地驅動惡性轉化。使用轉座子/質粒DNA（pDNA）載荷的非病毒遞送也存在類似風險，因為其能夠實現長期表達的整合。相比之下，大多數非病毒系統遞送mRNA，mRNA會迅速降解并僅支持短期表達。這最大限度地降低了突變風險。

mRNA的瞬時性質提高了安全性，但可能限制療效，特別是對于需要穩定表達以確保腫瘤清除和防止復發的CAR-T療法。因此，整合性和非整合性策略之間的選擇取決于疾病背景、包裝要求和安全性考慮。最近使用“混合”非病毒載體的工作已開始彌合這一鴻溝：靶向LNP制劑（例如NcTx）共同封裝編碼CAR的轉座子微環DNA和SB100x轉座酶mRNA，允許高效、T細胞特異性的體內CAR表達盒整合，并產生可持久數周并在人源化小鼠模型中控制B細胞白血病。

最有前景的非病毒平臺是LNP和多聚復合物。前者在FDA授權的輝瑞/BioNTech和Moderna的COVID-19疫苗中得到了驗證。LNP制劑通常包含四種脂質：可電離陽離子脂質、輔助脂質、膽固醇和聚乙二醇（PEG）-脂質綴合物。可電離脂質對生物相容性至關重要，在生理pH下保持中性，但在酸性內體條件下質子化以促進內體逃逸。mRNA-LNP平臺在體內CAR-T領域，幾種具有CD3、CD7或CD8靶向配體和結構優化的可電離脂質的平臺已在小鼠中實現了快速但短暫的CAR表達。相比之下，較新的基于DNA的LNP（例如NCtx）在單次給藥后誘導了更高、更持久的CAR-T水平，同時保持了非病毒制造的優點。

多聚復合物在過去二十年中也獲得了發展勢頭。這些聚合物納米顆粒是通過帶負電的核酸與陽離子聚合物自發靜電縮合形成的中間多電解質復合物。最廣泛使用的陽離子聚合物是聚-L-賴氨酸和聚乙烯亞胺。早期的概念驗證平臺實現了體內CAR-T生成，但效率適中，需要重復給藥；較新的LNP系統現在在效率方面超過了這些多聚復合物。

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三、病毒與非病毒載體的特異性和脫靶效應

大多數載體表現出廣泛的嗜性，缺乏細胞類型特異性。這增加了脫靶效應的風險，并可能需要更高劑量才能達到治療效果。特異性與載體如何進入細胞密切相關：這個過程越可定制，治療就越能精確地導向靶細胞，同時最小化脫靶進入。細胞進入主要由表面蛋白相互作用介導，這在不同的載體類型中有所不同。對于AAV和AdV，血清型通過聚糖和受體結合賦予不同的嗜性，這些自然變異可以進一步工程化以實現更大的組織特異性。LV和非病毒載體缺乏血清型多樣性，而是依賴于諸如假型化替代包膜蛋白（LV）或向載體表面摻入抗體等方法。

假型化和衣殼工程化

為了克服常見LV包膜蛋白VSV-G的廣泛嗜性，已探索了多種替代品。更新的基于尼帕病毒的“混合包膜”設計，結合了重新靶向和非靶向的G蛋白，以及識別CD3或CD8的緊湊型設計錨蛋白重復蛋白或重鏈抗體可變域，顯著增加了功能性滴度和體內T細胞特異性，同時最小化了肝臟轉導和脫靶髓系細胞攝取。

對于AAV，精細的血清型選擇是一種既定方法，用于優化組織特異性靶向。各種工程化方法，如合理設計、定向進化（DNA改組、易錯PCR、肽展示和定點誘變）以及計算機輔助設計，已被用于將嗜性重新導向野生型AAV血清型未覆蓋的靶點。此外，在合理設計中，引入點突變、插入高親和力配體或肽，以及實施化學生物學方法來合理修飾衣殼，也已顯示出改善靶特異性、增加基因表達和逃避先天免疫反應的能力。

定向進化提供了一種替代方法。已經產生了T細胞增強型AAV衣殼，例如Ark313，表現出比天然血清型更高的T細胞結合和轉導。它顯示出與AAV6相比肝臟靶向減少，表明具有良好的安全性特征。

表面修飾

載體特異性也可以通過摻入結合靶細胞特有細胞表面蛋白的抗體來增強。CD3標記T細胞，而CD4和CD8區分主要的T細胞亞群，使它們成為CAR-T應用的合乎邏輯的靶點。DARPin為抗體提供了一種替代方案。它們的小尺寸和高熱力學穩定性使其能夠高效表面表達，同時減少與抗體相比的聚集。將CD8靶向的DARPin摻入AAV中導致轉導增加了26倍，超過99%的GFP陽性細胞限制在CD8+細胞中。類似地，AdV-C5被工程化以攜帶DARPin三聚適配子，包含CD3、CD28和IL-2抗體片段，窄化了其嗜性并實現了高T細胞特異性，在外周血單核細胞中脫靶表達低于2%。

類似的表面修飾也已在非病毒系統中測試。CAR編碼的mRNA-LNP功能化有CD3、NKp46和CD14靶向抗體，能夠在人PBMC樣本中分別轉導90%的T細胞、20%的NK細胞和65%的單核細胞，在其他細胞類型中幾乎沒有脫靶表達。DARPin-病毒樣顆粒的效率較低，轉導20%的T細胞、20%的NK細胞和50%的單核細胞。這些結果表明DARPin-VLP在體內CAR-T應用中不如抗體-LNP有效，盡管該技術仍處于早期階段。臨床上多集中于CD7、CD3或CD8結合物，以重塑效應細胞群體。

另一種有前景的表面修飾方法是將陽離子、陰離子或可電離的選擇性器官靶向脂質摻入LNP。在小鼠研究中，該技術已能夠根據脂質組成將mRNA和其他核酸或蛋白質貨物特異性地遞送到肝臟、肺或脾臟。此外，嗜性可以通過可電離脂質的結構優化來引導。最近的一項研究證明了雜化脂質-聚合物納米顆粒成功遞送到脾臟。

轉導前的T細胞激活

通過T細胞受體和/或增殖性細胞因子的給藥進行預先激活，是離體有效轉導原代T細胞的必要條件。這通常通過使用靶向CD3/CD28受體的激活顆粒，結合IL-2或IL-7/IL-15來實現。體內CAR-T生成面臨的挑戰是，基于顆粒的激活是不可能的。

為了克服體內T細胞激活的缺乏，已經開發了結合激活和轉導的策略。例子包括CD3靶向的LV和工程化有三聚體適配子攜帶CD3、CD28和IL-2的HAdV-C5載體。通過在其表面摻入抗CD3和抗CD28抗體，這些LNP能夠在一個步驟中同時實現T細胞激活和CAR-mRNA遞送。另外，來自第四代CD3和CD8靶向LV的最新數據表明，可以在沒有直接TCR參與的情況下在體內產生高水平的CAR-T細胞，前提是在載體給藥前給予細胞因子支持（如IL-7）。

高效基因遞送——內體逃逸

除了表面蛋白修飾外，其他幾個因素也影響遺傳載荷的遞送，尤其是對于非病毒載體。納米顆粒大小是一個決定因素：較大的顆粒通常比較小的顆粒攝取效率低。影響LNP或多聚復合物大小的因素包括核酸、脂質或聚合物組成、表面電荷以及靶向配體的存在與否或濃度。

內吞本身只是挑戰的一部分，因為內體逃逸通常是限制步驟。在一項研究中，siRNA-LNP在30分鐘內顯示出在HeLa細胞中95%的攝取，但只有不到2%的siRNA到達細胞質。可電離脂質被認為在這里至關重要，因為它們在低pH下質子化，使內體膜不穩定并促進逃逸。最近的工作還表明，載荷不是被釋放到細胞質中，而是可以被重新包裝到細胞外囊泡中，可能介導向其他細胞的轉移。

最佳基因表達——組織特異性啟動子和mRNA序列優化

遞送之后，基因序列必須以適當的水平表達：過度表達可能導致不良效應，而表達不足則降低療效。啟動子是蛋白質表達的關鍵調節因子，與目標基因一起構成表達盒的一部分。一些啟動子是細胞類型特異性的，可以利用它們來改善靶向。對于離體CAR-T，最廣泛使用的啟動子是延伸因子1-α，它在T細胞中提供高且持久的表達。對于體內應用，啟動子應最大化在靶細胞中的表達，同時最小化脫靶表達。該領域的研究仍然有限，部分原因是啟動子的選擇不僅影響表達特異性，還影響活性的持續時間和細胞表面的CAR密度。

對于基于mRNA的方法，非翻譯區是調節蛋白質表達的。UTR序列的優化可以增強CAR表達水平，并且正在開發模型以針對不同組織類型（包括T細胞）調整UTR。另一種類型的UTR操作涉及在UTR區域之一添加位點，用于肝臟特異性miRNA（參與轉錄后調節）。這可以防止CAR基因在肝細胞中表達，代表了一種調節脫靶效應的方法。超越UTR區域，計算算法可用于優化RNA密碼子，選擇宿主細胞最有效翻譯的序列。

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四、病毒與非病毒載體的生物分布和器官毒性

特異性通過確定載體的生物分布直接影響安全性。主要擔憂是器官毒性，特別是在靜脈內給藥后。由于肝臟在血液過濾和解毒中的核心作用，載體經常在其中積累。這減少了到達靶組織的載體量，并引發了對肝毒性的嚴重擔憂。

肝臟積累也是AdV的一個擔憂。為了減輕這種影響，已經開發了稱為屏蔽重新靶向腺病毒的屏蔽載體，以減少肝臟攝取和毒性。然而，這也降低了轉導效率，在早期研究中，與未屏蔽的HAdV-C5相比，轉導的T細胞減少了多達60%。屏蔽減少了免疫識別，這對于AdV尤其重要，因為其具有高內在免疫原性。

對于非病毒載體，據報道，30%至99%的靜脈內給藥的納米顆粒會在肝臟積累。盡管如此，用于體內CAR-T治療的LNP的近期臨床前測試并未揭示任何毒性或器官損傷的跡象。然而，新興的單顆粒和高含量成像研究表明，LNP大小、表面化學和蛋白質冠組成的微妙變化可以顯著影響補體激活、庫普弗細胞攝取和細胞因子釋放，強調需要將詳細的物理化學表征與體內免疫毒性聯系起來。

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五、病毒與非病毒載體的持久性和基因插入風險

載體可根據細胞內穩定性分為兩類：整合型和非整合型。這些方法對持久性和安全性都有明確的影響。整合型載體實現CAR基因永久整合到T細胞中，有可能在患者體內產生持久的CAR-T細胞。相比之下，非整合型方法將創建一個瞬時CAR-T細胞群體，一旦AAV或mRNA分子被分解，T細胞就會停止表達CAR。

考慮到安全性，非整合型方法不與靶細胞基因組相互作用這一事實是一個主要優勢，基本上排除了基因插入的風險。然而，隨機插入和潛在癌基因激活仍然是整合型系統的主要安全問題。廣泛用于離體CAR-T療法的LV采用“復制-粘貼”機制，其中RNA基因組被逆轉錄為DNA并插入宿主基因組。盡管LV優先整合到癌基因之外的區域，但突變發生的風險不能完全排除。FDA在2024年要求在所有BCMA或CD19導向的自體CAR-T產品中加入黑框警告標簽，警告治療后T細胞惡性腫瘤的風險。

為減輕這些風險，先進的LV載體已去除長末端重復序列中的增強子和啟動子元件，以創建自失活載體。在離體療法中，細胞可以在輸注前進行高風險整合篩選。然而，體內應用直接在患者體內修飾細胞，因此最小化插入突變發生是必不可少的。正在研究的策略包括位點特異性整合和限制每個靶細胞的拷貝數。

與LV的“復制-粘貼”機制不同，轉座子使用“剪切-粘貼”過程，其中轉座酶從轉座子DNA中切除基因并將其插入，通常插入基因間區域而不是基因富集區域。轉座子對整合位點提供更多控制，并可能減少對關鍵宿主基因的破壞。例如，SB100x Sleeping Beauty轉座酶顯示出與逆轉錄病毒載體相比，隨機整合模式，靶向基因和調控區域的傾向性較低，因此已被選擇用于T細胞靶向DNA LNP平臺，如NCtx。然而，在不同轉座酶piggyBac的首次人體試驗中，觀察到兩名患者出現CAR-T淋巴瘤。

除了LV或轉座酶方法外，基于CRISPR的基因編輯正逐漸應用于基于基因組的CAR-T細胞生成。與半隨機整合的LV不同，CRISPR能夠在gRNA定義的位點進行靶向插入，允許對整合位點進行精確控制。T細胞受體α恒定區（TRAC）位點被認為是CAR插入的金標準。CRISPR介導的敲入的一個關鍵限制在于其對同源定向修復的依賴性，這發生頻率較低且比非同源末端連接介導的敲除更難激活。持續改進HDR增強和遞送技術將是CRISPR敲入與病毒轉導效率競爭所必需的。

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六、病毒與非病毒載體的免疫原性

免疫原性是選擇載體時的關鍵因素，考慮到與離體CAR-T和體內基因療法相關的CRS和神經毒性風險。這種不良事件可能會超過治療益處，或者在療效實現之前清除治療劑。

僅當CAR表達T細胞在體內持續存在時，CAR-T療法才有效。理論上對于整合型載體無需重復給藥。相比之下，瞬時表達的重復給藥模型更適合自身免疫和心血管應用。目前，針對載體或核酸在重復給藥后的免疫是一個重大挑戰，特別是對于AAV和AdV。正在研究策略如蛋白酶IdeS和納米顆粒平臺ImmTOR，分別用于減少載體特異性抗體和防止中和抗體的形成。

包膜蛋白進一步影響免疫原性。非病毒載體通常表現出較低的免疫原性，從而增強了安全性并提高了重復給藥的潛力。這得到了基于LNP的COVID-19疫苗安全使用的支持，盡管體內CAR-T可能需要更高劑量以引發更強反應。一種有前景的替代方案是自擴增RNA，它編碼一種在細胞中擴增mRNA的復制酶。

PEG是LNP的標準成分，會觸發先天免疫激活和補體反應，特別是在重復給藥后。雖然這在疫苗中可能是有利的，但在CAR-T中是有問題的。緩解策略包括優化制劑以最小化免疫刺激成分，或共同遞送siRNA以抑制細胞因子產生。臨床階段的LNP故意調整可電離脂質化學和顆粒穩定性，以實現“雪花狀”短壽命特征，最小化全身反應原性并有利于受體介導的攝取，這種設計旨在支持慢性自身免疫適應癥中的重復給藥。

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七、病毒與非病毒載體的制造與成本

體內CAR-T生產不同于離體方法，它側重于載體或載荷的制造，而不是收獲、激活、基因修飾和擴增T細胞。因此，載體選擇與能夠滿足患者需求的可擴展技術的可用性相關。體內載體的下游加工比離體使用的載體更復雜，因為殘留的宿主蛋白、DNA、轉染試劑和核酸內切酶必須在給藥前去除。

可擴展的病毒載體生產仍然是成本降低的重大挑戰，盡管正在努力提高生產率。高原材料成本，特別是GMP級pDNA和PEI，主導了支出，并存在全球性的pDNA產能短缺。純化也由于產品損失而大大增加了成本。pDNA短缺同樣影響非病毒載體。替代策略包括使用酶促過程進行合成pDNA生產。

與病毒系統相比，mRNA-LNP平臺受益于基本上是序列無關的特性，加工步驟無論mRNA靶點如何都保持不變。原材料成本在所有載體類型中仍然是顯著支出，約占LV總成本的40-50%，AAV的32%，以及LNP的73%。對于病毒系統，PEI和無血清培養基主導成本，而對于非病毒系統，RNA聚合酶和可電離脂質是最昂貴的組件。微流控系統現在解決了這些問題，能夠實現可重復、可擴展和精確的生產。

總體而言，非病毒載體的制造成本低于病毒系統，因為LNP和多聚復合物生產通常由更可重復和可擴展的工作流程組成。它們的無細胞性質也縮短了生產時間，并允許重新利用為無菌注射劑設計的設施。盡管如此，LV、AAV和AdV的既定基礎設施和生物學優勢確保了病毒和非病毒載體將繼續并行發展，各自適用于不同的應用。

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結語

體內CAR-T療法代表了免疫工程中的一個概念性轉變，將遺傳修飾從受控的離體制造過程轉移到患者體內。這種轉變擴展了治療靈活性，但也引入了必須仔細權衡的新生物學、技術和轉化變量。體內策略并未取代離體方法，而是將CAR平臺擴展成一個模塊化系統，其中載體設計、基因組持久性和細胞靶向可以根據疾病背景進行定制。

體內CAR-T應被視為一種獨特的監管和生物學模式。沒有單一的載體適用于所有應用。進展將取決于將病毒和非病毒技術都調整到適應癥的需求。實現這一目標需要載體工程、制造創新、分析開發和監管科學的謹慎整合。如果成功，體內免疫工程可以將CAR-T從一種定制化、受限于醫院的干預措施轉變為一個廣泛可及、模塊化的治療類別，涵蓋腫瘤學、自身免疫性疾病等領域。

參考資料：

On the road to in vivo CAR-T success: Comparing promising viral and non-viral vectors.

Biotechnol Adv. 2026 Sep:90:108907.