不用等光子集齊AI算出超清圖像！清華讓熒光壽命成像告別光子焦慮

熒光顯微鏡是生命科學(xué)研究的一雙重要“眼睛”。科學(xué)家可以用熒光分子標(biāo)記細(xì)胞、蛋白質(zhì)，再觀察它們出現(xiàn)在哪里、怎樣運(yùn)動(dòng)以及信號(hào)如何變化。

不過，普通熒光成像主要看亮度。一個(gè)位置更亮，可能意味著目標(biāo)分子更多，但也可能只是熒光探針更多、激發(fā)光更強(qiáng)，或者組織對(duì)光的衰減更少。因此，“變亮了”并不總能直接告訴我們分子發(fā)生了什么變化。

除了亮度之外，熒光其實(shí)還隱藏著另一個(gè)重要信息：壽命。

熒光分子吸收光子后，會(huì)短暫進(jìn)入激發(fā)態(tài)，隨后返回基態(tài)并釋放光子。它在激發(fā)態(tài)平均停留的時(shí)間，就是熒光壽命（Fluorescence Lifetime）。

與亮度相比，熒光壽命不容易受到探針濃度和激發(fā)功率等因素影響，卻會(huì)隨著熒光分子構(gòu)象和周圍微環(huán)境發(fā)生變化。在顯微成像中測(cè)量這一時(shí)間信息的技術(shù)，被稱為熒光壽命成像顯微術(shù)（fluorescence lifetime imaging microscopy，F(xiàn)LIM）。借助 FLIM，研究人員可以進(jìn)一步了解離子濃度、能量代謝、分子相互作用和蛋白質(zhì)構(gòu)象等傳統(tǒng)強(qiáng)度成像難以直接觀察的信息，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和病理學(xué)研究。

但這種信息更豐富的成像方式，一直受到一個(gè)現(xiàn)實(shí)問題的限制：太依賴光子（光的最小單位）。傳統(tǒng) FLIM 要反復(fù)激發(fā)同一個(gè)像素（樣本里的同一個(gè)區(qū)域），積累大量光子的到達(dá)時(shí)間形成直方圖，再估算熒光壽命。這不僅拖慢成像速度，提高激發(fā)功率，還可能加重光漂白和光毒性。

近日，清華大學(xué)戴瓊海院士、吳嘉敏副教授團(tuán)隊(duì)在 Nature Biotechnology發(fā)文。他們提出首光子事件感知熒光壽命成像方法 EFLIM（event-based first-photon FLIM），這種方法不再等待每個(gè)像素積累大量光子，而是重新利用每一次激發(fā)及首達(dá)光子的時(shí)間信息。即使平均每個(gè)像素探測(cè)到的光子低于 1 個(gè)，EFLIM 仍能恢復(fù)出穩(wěn)定的熒光壽命圖像。

為什么一定要壘直方圖？

熒光壽命的定量測(cè)量可追溯至 20 世紀(jì)早期，但直到 20 世紀(jì) 90 年代，將壽命測(cè)量與顯微成像結(jié)合的熒光壽命成像技術(shù)（FLIM），才真正得以實(shí)現(xiàn)。時(shí)至今日，F(xiàn)LIM 已被集成到一些商業(yè)顯微系統(tǒng)中，但其使用相較強(qiáng)度成像仍未廣泛普及。一個(gè)關(guān)鍵瓶頸在于：熒光壽命的精確估計(jì)極度依賴海量光子的累積。

傳統(tǒng) FLIM 通常使用脈沖激光激發(fā)樣品，再記錄熒光光子相對(duì)于激發(fā)脈沖的到達(dá)時(shí)間。由于單個(gè)光子的發(fā)射時(shí)間具有隨機(jī)性，研究人員需要反復(fù)激發(fā)同一個(gè)像素，把大量光子的到達(dá)時(shí)間“壘”成一張直方圖，再通過數(shù)學(xué)擬合估算熒光壽命。

“直方圖需要足夠多的光子才能壘得完整，一般認(rèn)為每個(gè)像素點(diǎn)至少需要積累 3,000 個(gè)光子；即便在對(duì)精度要求較低或算法有所優(yōu)化的情況下，數(shù)百個(gè)光子也是維持壽命估計(jì)可信度的底線。”這項(xiàng)研究的第一作者周逸亮表示。

然而，真實(shí)的生物樣品不會(huì)那么“客氣”。為了獲得更多光子，研究人員可以延長采集時(shí)間或提高激發(fā)功率，但前者可能錯(cuò)過快速變化的生命過程，后者則會(huì)增加光漂白和光毒性。進(jìn)入深層組織后，激發(fā)光和返回的熒光還會(huì)被組織吸收衰減，問題更加嚴(yán)重。

因此，在光子很少的情況下，怎樣估算熒光壽命是這個(gè)領(lǐng)域需要解決的重要問題，也是這項(xiàng)工作關(guān)注的核心。

周逸亮此前學(xué)習(xí)光學(xué)，是實(shí)驗(yàn)室里第一個(gè)系統(tǒng)開展熒光壽命研究的人。從系統(tǒng)搭建、參數(shù)調(diào)試到算法仿真，他幾乎從頭學(xué)起。最初，團(tuán)隊(duì)和許多同行一樣，把主要精力放在如何從稀疏、不完整的光子直方圖中得到更好的壽命估計(jì)。“我們圍繞這件事轉(zhuǎn)了很久。后來突然想到，大家都在壘直方圖，但為什么我們一定要壘直方圖？”他回憶道。

在周逸亮看來，這個(gè)轉(zhuǎn)折也是整項(xiàng)研究中最有意思的部分：“我們突然意識(shí)到，不一定非要重復(fù)別人上來第一步就做的事情，或許可以嘗試一些更有意思、更勇敢，甚至更加瘋狂的操作。”

于是，團(tuán)隊(duì)決定回到更原始的數(shù)據(jù)層面。EFLIM 不再先把多次激發(fā)結(jié)果合并，而是把每次激光激發(fā)視為一個(gè)獨(dú)立事件：這次有沒有探測(cè)到光子；如果有，第一個(gè)光子何時(shí)到達(dá)。

這一思路受到 2014 年發(fā)表于 Science的“首光子成像”（First-photon imaging）研究啟發(fā)。該方法利用每個(gè)像素最先探測(cè)到的光子及其到達(dá)時(shí)間，在極低光照下恢復(fù)宏觀場(chǎng)景的反射率和三維結(jié)構(gòu)。“這項(xiàng)工作用首光子到達(dá)時(shí)間估計(jì)場(chǎng)景信息，我們就想到，在熒光壽命顯微成像中，能不能也充分利用這個(gè)時(shí)間來估算熒光壽命？”周逸亮說。

（來源：Nature Biotechnology）

他解釋道，之所以關(guān)注首光子，并不是因?yàn)榈谝粋€(gè)光子天然包含更多信息，而是受到探測(cè)器工作方式的影響。在一次激發(fā)周期內(nèi)，許多單光子探測(cè)系統(tǒng)通常記錄最先到達(dá)的光子；在極低光照下，每次激發(fā)也往往只有一個(gè)光子，甚至沒有光子。與其把這些記錄合并成高度稀疏的直方圖，不如圍繞每次激發(fā)和首光子重新設(shè)計(jì)壽命估計(jì)方法。

光子這么少，AI 怎樣估算壽命？

但只有零散的首光子事件，還不足以讓每個(gè)像素獨(dú)立算出壽命。EFLIM 的另一個(gè)關(guān)鍵，是將原本的壽命參數(shù)估計(jì)，轉(zhuǎn)化為時(shí)空自監(jiān)督去噪問題。

熒光分子每次被激發(fā)后，在激發(fā)態(tài)停留的時(shí)間具有隨機(jī)性，但大量事件在統(tǒng)計(jì)上遵循一定規(guī)律，熒光壽命可以理解為這一隨機(jī)分布的平均值。EFLIM 利用這一特點(diǎn)，綜合相鄰位置和前后幀中的稀疏光子信息，估計(jì)平均首光子到達(dá)時(shí)間，再將其轉(zhuǎn)換為表觀平均壽命。

團(tuán)隊(duì)最初也考慮過傳統(tǒng)的有監(jiān)督學(xué)習(xí)，即讓模型把高光子壽命圖像作為標(biāo)準(zhǔn)答案。但熒光壽命對(duì)分子構(gòu)象和局部微環(huán)境非常敏感，不同樣本之間即使只有細(xì)微差別，壽命分布也可能發(fā)生變化。要讓一個(gè)模型適用于多種生物場(chǎng)景，就需要采集大量覆蓋不同樣本的高光子訓(xùn)練數(shù)據(jù)，成本高、難度也很大。

因此，團(tuán)隊(duì)轉(zhuǎn)向自監(jiān)督學(xué)習(xí)。模型不需要把高光子壽命圖像作為訓(xùn)練標(biāo)簽，而是利用稀疏數(shù)據(jù)自身構(gòu)造學(xué)習(xí)信號(hào)。首光子事件表示解決了怎樣利用每次激發(fā)的問題，自監(jiān)督學(xué)習(xí)則解決了沒有大量標(biāo)準(zhǔn)答案，模型怎樣訓(xùn)練的問題，兩者共同構(gòu)成了 EFLIM 的技術(shù)架構(gòu)。

不過，借助相鄰位置和前后幀進(jìn)行估計(jì)，也帶來一個(gè)疑問：AI 會(huì)不會(huì)只是在“猜”出一張看起來清楚的圖？

“光子越多，信息越多，估計(jì)結(jié)果就越接近真實(shí)值。當(dāng)光子實(shí)在太少時(shí)，壽命估計(jì)一定會(huì)出現(xiàn)更大的偏差。”周逸亮說，“重要的不是聲稱完全消除偏差，而是盡可能定量地把偏差標(biāo)定出來。”

為此，團(tuán)隊(duì)首先通過仿真改變光子數(shù)量、壽命分布和樣本運(yùn)動(dòng)速度，觀察誤差如何變化，判斷方法在什么條件下可信、在什么條件下可能失效。隨后，他們又使用真實(shí)樣本進(jìn)行驗(yàn)證：先以大量光子獲得參考結(jié)果，再逐步降低光子預(yù)算，與 EFLIM 的估計(jì)結(jié)果比較。

用于基礎(chǔ)驗(yàn)證的是一塊固定松莖橫切片，這塊樣品已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室放了四五年，周逸亮把它從角落里翻出來。由于其中恰好具有豐富的微觀結(jié)構(gòu)和不同壽命分布，它最終成了檢驗(yàn) EFLIM 準(zhǔn)確性和適用邊界的合適樣本。

團(tuán)隊(duì)先對(duì)每個(gè)像素進(jìn)行 20 萬次激發(fā)，獲得高光子參考數(shù)據(jù)，再從中抽取少量激發(fā)事件，模擬不同光子預(yù)算。在每個(gè)像素每幀僅進(jìn)行 10 次激發(fā)、平均獲得約 0.025-0.15 個(gè)光子的條件下，EFLIM 仍恢復(fù)出穩(wěn)定的熒光壽命結(jié)構(gòu)，壽命信噪比約為 17dB。優(yōu)于其他方法在每像素進(jìn)行 1 萬次激發(fā)、平均獲得 25-150 個(gè)光子時(shí)的結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)數(shù)量級(jí)以上的有效光子效率提升。

（來源：Nature Biotechnology）

從活細(xì)胞到腫瘤組織，EFLIM 能用在哪里？

團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步將 EFLIM 應(yīng)用于清醒小鼠腦內(nèi)成像、活細(xì)胞鈣信號(hào)成像、淋巴結(jié)免疫反應(yīng)成像和人腦膠質(zhì)瘤組織快速無標(biāo)記成像。

在清醒小鼠腦內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物運(yùn)動(dòng)、血流變化及鈣活動(dòng)都會(huì)引起熒光強(qiáng)度波動(dòng)，容易干擾傳統(tǒng)方法的判斷。團(tuán)隊(duì)在約 250 微米深的腦組織中記錄神經(jīng)元活動(dòng)，EFLIM 能夠減少運(yùn)動(dòng)偽影和強(qiáng)度變化對(duì)壽命估計(jì)的影響，在低光子條件下獲得更穩(wěn)定、可重復(fù)的壽命讀數(shù)，展現(xiàn)出其用于清醒動(dòng)物腦內(nèi)神經(jīng)活動(dòng)觀測(cè)的潛力。

團(tuán)隊(duì)用 EFLIM 觀察 HeLa 細(xì)胞內(nèi)的鈣信號(hào)時(shí)，在高速成像（每秒 30 幀）、每個(gè)像素平均只有 0.2-0.5 個(gè)光子的條件下，清晰捕捉到了鈣信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化，準(zhǔn)確計(jì)算出鈣離子濃度的定量波動(dòng)，解決了傳統(tǒng) FLIM 成像慢、信號(hào)弱的問題。

在淋巴結(jié)免疫反應(yīng)成像中，團(tuán)隊(duì)用 EFLIM 在單一光譜通道中，根據(jù)不同免疫細(xì)胞的熒光壽命差異，清晰區(qū)分了 B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞，還觀察到 T 細(xì)胞釋放的囊泡樣結(jié)構(gòu)，以及這些囊泡可能介導(dǎo)的細(xì)胞間通信，為免疫反應(yīng)研究提供了新視角。

（來源：Nature Biotechnology）

傳統(tǒng)病理檢測(cè)需要對(duì)組織進(jìn)行染色，過程繁瑣且耗時(shí)。EFLIM 可以利用生物組織內(nèi)源性分子的自發(fā)熒光壽命，實(shí)現(xiàn)無標(biāo)記成像，快速區(qū)分膠質(zhì)瘤組織中的腫瘤細(xì)胞、正常細(xì)胞、血管、壞死區(qū)域等。而且成像速度快、覆蓋范圍廣，能拼接成厘米尺度的組織圖像，有望用于腫瘤邊界識(shí)別、術(shù)中實(shí)時(shí)評(píng)估，為臨床治療提供參考。

（來源：Nature Biotechnology）

但 EFLIM 的潛在應(yīng)用并不限于這幾個(gè)場(chǎng)景。周逸亮認(rèn)為，只要光子受限，這項(xiàng)方法就可能發(fā)揮作用。例如在深層組織、視網(wǎng)膜和其他低光度成像場(chǎng)景中，樣本無法承受過強(qiáng)照射等。

EFLIM 還可能拓展熒光壽命探針的應(yīng)用空間。目前，可用于定量壽命讀出的高性能探針仍相對(duì)有限。通過降低壽命估計(jì)對(duì)光子數(shù)量的需求，EFLIM 有望提升信號(hào)較弱或表達(dá)水平較低的壽命探針在高速、低光照和深層組織成像中的可用性，拓展現(xiàn)有壽命探針的適用范圍。

更長遠(yuǎn)的價(jià)值在于推動(dòng)定量生物學(xué)。熒光壽命能夠減少探針濃度、激發(fā)功率和部分強(qiáng)度偽影帶來的干擾，使研究人員更定量地觀察生物指標(biāo)如何變化，并尋找免疫反應(yīng)和神經(jīng)活動(dòng)中的新線索。

不過，周逸亮也坦言，EFLIM 仍有較大的優(yōu)化空間。硬件方面，目前系統(tǒng)使用的光電倍增管對(duì)光子的探測(cè)效率有限。如果未來與量子效率更高的單光子探測(cè)器結(jié)合，有望進(jìn)一步擴(kuò)大其在極低光子條件下的適用范圍。

另一個(gè)值得探索的方向是高通量多組分成像。熒光壽命可以作為區(qū)分不同分子或細(xì)胞組分的獨(dú)立維度；將其與熒光強(qiáng)度、光譜和偏振等信息結(jié)合，有望在有限的探測(cè)通道內(nèi)實(shí)現(xiàn)更高水平的多重成像，從而更全面地揭示復(fù)雜生物系統(tǒng)的分子組成、空間關(guān)系和動(dòng)態(tài)變化。

1. Zhou, Y., Xiao, Y., Zhou, J. et al. High-fidelity fast fluorescence lifetime imaging by event-based denoising. Nat Biotechnol (2026). https://doi.org/10.1038/s41587-026-03222-0

2. Kirmani A, Venkatraman D, Shin D, Cola?o A, Wong FN, Shapiro JH, Goyal VK. First-photon imaging. Science. 2014 Jan 3;343(6166):58-61. doi: 10.1126/science.1246775.

排版：胡莉花

注:封面/首圖由 AI 輔助生成