諾獎得主Doudna團隊用AI發明新型“基因剪刀”，比天然的更好用

2020 年，珍妮弗·杜德納（Jennifer Doudna）與埃瑪紐埃勒·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）因共同開發 CRISPR-Cas9 基因編輯技術共獲諾貝爾化學獎。

隨著 AI 與大語言模型的爆發，近幾年，珍妮弗的實驗室逐漸將研究重心轉向一個新方向：用人工智能（AI）創造自然界不存在的基因編輯工具。

7 月 16 日，珍妮弗團隊在《科學》（Science）發文，介紹了一類名為 SynTnpB 的 AI 設計基因編輯蛋白。SynTnpB 蛋白在細菌類、動物和植物細胞中均表現出編輯活性，部分變體活性甚至超過天然酶。研究者還用冷凍電鏡（cryo-EM）解析了其中一種變體的三維結構，并首次從原子層面剖析 AI 設計核酸酶的分子邏輯。

（來源：Science）

蛋白質通常由氨基酸序列折疊成不同三維結構得到。在 AI 蛋白質設計領域，AlphaFold 解決了結構預測問題，已有一些模型在結合蛋白、動態開關等相對簡單的設計任務上達成目標，但對于具有多個功能結構域、多種構象狀態的復雜酶，AI 一直難以設計出令人滿意的結構。

尤其是 CRISPR-Cas 系統中的核酸酶，它們需要同時識別 RNA 和 DNA，并在不同催化狀態間切換，才能精準剪切 DNA。

但用 AI 設計基因編輯蛋白不是此次團隊的首創。2024 年，由前谷歌研究員創立的 AI 蛋白設計公司 Profluent 發布了 OpenCRISPR-1，聲稱是首個完全由 AI 生成的 CRISPR 編輯器。該蛋白與 SpCas9（當前應用最廣泛的天然 Cas 核酸酶）有 400 余處突變差異，與最接近的天然同源物也有約 180 處差異，在人類細胞中顯示出與 SpCas9 相當的編輯活性和更低的脫靶率。

新研究指出，盡管這些基于序列語言模型（LM）生成的蛋白，整體與天然序列存在數百處差異，其 DNA 結合結構域與天然同源物的序列一致性仍超過 99%，AI 做到的更接近"重排"而非"創造"。

AI 真正自主設計出的復雜酶，應在功能核心區域與天然酶發生大幅度的序列偏離，活性至少保持不變，甚至要做到更優。

為此，團隊選擇 TnpB（轉座酶 B）作為驗證對象。TnpB 因最初在轉座子中發現而得名，被認為是 CRISPR-Cas12 的演化祖先。TnpB 僅有 408 個氨基酸，約為 SpCas9 的三分之一，但保留了 RNA 引導 DNA 切割的完整功能，識別和切割機制也與 Cas9 相似。TnpB 家族在細菌、古菌乃至真核生物中廣泛存在，多樣性豐富。

蛋白質的三維結構決定其功能，但不同的氨基酸序列可以折疊成相同的結構。研究團隊使用了 Meta 于 2022 年發布并開源的逆向折疊模型 ESM-IF1，該模型基于 AlphaFold2 預測的 1,200 萬個蛋白結構訓練而成。在模型中給定一個蛋白骨架的三維坐標，即可生成與之相容的新氨基酸序列。研究者輸入 TnpB 的結構，讓 ESM-IF1 反推出全新的序列。

一開始，團隊只用初始模型，得到的序列不夠理想。ESM-IF1 能正確恢復 TnpB 的整體折疊和催化三聯體結構，但在蛋白與核酸接觸的界面上引入了錯誤突變。這代表 ESM-IF1 只能看懂蛋白的靜態骨架，卻并不了解 TnpB 的具體功能。

解決方案是為 AI 引入演化約束。研究者對天然 TnpB 進行多序列比對，最終提取出兩類信號，一類是位置保守性，反映某個位置在自然選擇中改變的頻率；另一類是共進化耦合強度，反映蛋白殘基與核酸堿基之間的共同演化關系。

兩類信號條件都滿足的殘基被鎖定為野生型序列，其余位置交給 ESM-IF1 自由生成。通過調節保守性和耦合強度，研究人員還能精確控制 AI 設計蛋白質的自由度：閾值越高，被鎖定的殘基越少，生成序列的差異化程度越大。

另一個關鍵的實驗設計是分域策略。TnpB 由負責 DNA 識別的 REC 域和負責 RNA 結合與催化的 NUC 域構成。研究者將兩個域分別設計并進行測試。結果發現，NUC 域對序列變化的兼容度遠高于 REC 域。這一發現暗示，設計多結構域蛋白時，不能統一處理，需要對不同功能域獨立優化。

研究人員讓 AI 分別獨立生成兩個域的變體，再進行兩兩組合，最終得到 1,980 種全新的 TnpB 類蛋白，評估篩選后發現，其中 466 種具有可檢測的切割活性，占測試總數的 24%，約 8% 的活性超過野生型 ISDra2 TnpB。研究者從中選出 9 個綜合表現最佳的變體（v1 至 v9）進入真核細胞測試。

在人類胚胎腎細胞（HEK293T）敲除實驗中，野生型 TnpB 的編輯效率為 28%，v1 和 v5 分別達到 46% 和 50%；在內源基因位點上，v1 在 EMX1 位點的編輯效率甚至是野生型的 3.8 倍；特異性方面，v1 與野生型相當；在擬南芥的基因編輯實驗中，v1 在幾乎所有測試靶點上都優于野生型。

AI 生成變體中，離天然蛋白“最遠”的是 v7，其與野生型 ISDra2 TnpB 的一致性僅為 77%，偏離程度遠超此前序列語言模型設計出的蛋白。

為探究原因，研究者對 v7 在兩個催化狀態下的三元復合物（蛋白-RNA-DNA）分別進行冷凍電鏡解析，并通過實驗驗證功能。

結果發現，在 RNA-蛋白界面，AI 引入的殘基突變構建了一個正電荷富集區，與保留下來的野生型殘基協同穩定 RNA 骨架。在 REC 域，生成的殘基與 RNA-DNA 異源雙鏈形成新的接觸。而在催化裂縫上方，AI 還直接設計出了野生型 TnpB 中不存在的分子接觸。

（來源：Science）

需要明確，ESM-IF1 訓練時并未接觸任何核酸序列信息，它從蛋白結構中推斷出的殘基排布卻與 TnpB 的構象運動高度契合。

研究者據此推測，逆向折疊模型可能自發學到了與核酸結合和構象轉換相容的序列約束。這一結論如果成立，有助于我們更深入地理解大型蛋白質模型的內部表征。

實驗證實，AI 從結構與進化信息中獨立“發現”的突變，確實部分具備提升編輯活性等功能。例如，一段幾乎完全由 ESM-IF1 重新設計的螺旋片段，實現了野生型 TnpB 中類似結構促進異源雙鏈形成的功能。

在基因編輯領域，即便能通過 AI 工具設計更強大的 TnpB 體系，但因識別與激活切割的機制更為嚴格，TnpB 的編輯效率依然低于 SpCas9 系統，可用性不及后者。

但 TnpB 可以在一些特殊領域發揮作用。在基因治療領域，常用的載體是腺相關病毒（AAV），其遞送載體裝載上限為 4.7 kb。但 SpCas9 的編碼序列長達 4.1 kb，加上啟動子和調控元件后很容易“超載”。這時，編碼序列僅約 1.2 kb 的 TnpB 就派上了用場。

此前，野生型 TnpB 的切割活性不足，但 AI 設計出的 SynTnpB v1 和 v5 變體，已經能將部分位點的編輯效率提升至與 Cas9 相近的水平。

作為 CRISPR 基礎生物學發現者和多家基因編輯公司（Caribou、Intellia、Mammoth、Scribe 等）的聯合創始人，珍妮弗的產學連結網有望推動這類新技術加速走向臨床應用。

從 2012 年發現 CRISPR-Cas9，再到如今用 AI 創造全新核酸酶，科學家開始不滿足于翻找大自然的工具箱，還想親自造一把更趁手的。未來，團隊希望更進一步，深入探索從頭設計（de novo design），以此擴展可設計的蛋白質空間。

參考內容：

https://www.science.org/doi/10.1126/science.aed6123

運營/排版：何晨龍

注：封面/首圖由 AI 輔助生成諾獎得主Doudna團隊用AI發明新型“基因剪刀”，比天然的更好用