《Bioact. Mater.》華科張明昌/武大蔡杰團隊：多功能復合水凝膠抗菌協同趨化內源性干細胞促進細菌性角膜炎損傷修復

近期，華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院張明昌團隊和武漢大學化學與分子科學學院蔡杰團隊在科愛創辦的期刊Bioactive Materials上聯合發表文章：多功能復合水凝膠抗菌協同趨化內源性干細胞促進細菌性角膜炎損傷修復。通過開發一種多功能水凝膠平臺，將抗菌作用與內源性角膜組織再生結合，提出了一種治療細菌性角膜炎的變革性方法。QUDCS的強效抗菌特性協同SDF-1再生信號解決了當前臨床上綠膿桿菌性角膜炎面臨的感染控制和組織修復雙重挑戰。該體系將“抗菌—干細胞招募”結合，為感染性角膜疾病提供從單一抗菌向整合治療的新策略。

01

研究內容簡介

目前由耐藥菌引起的細菌感染已是全球公共衛生面臨的嚴峻挑戰，發展新型具有抗菌作用且不易產生耐藥性的抗菌材料勢在必行。殼聚糖——一種經甲殼素去乙酰化獲得的陽離子多糖，通過靜電破壞細菌膜顯示出固有的抗菌活性。綠膿桿菌感染性角膜炎是一種極具破壞性的角膜感染性疾病。其起病急、發展迅速，感染早期即出現大量炎性細胞浸潤，極易導致角膜穿孔。這一臨床現實強調了迫切需要創新的治療方法，同時克服生物膜耐藥性和促進組織再生。生物材料工程的最新進展，包括抗菌肽、納米顆粒和殼聚糖等，通過整合抗菌和再生平臺為解決這些挑戰提供了變革性的機會。基質細胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）是目前已知的對干細胞動員趨化作用最強的因子之一。因此我們提出科學假說：利用均相合成反應構建水凝膠SDF-1/QUDCS/OD，該水凝膠系統可以原位成型覆蓋角膜缺損部位避免角膜穿孔，QUDCS的高陽離子密度靜電破壞綠膿桿菌生物膜并穿透生物膜基質發揮抗菌作用；緩釋的SDF-1建立了持續的趨化梯度，通過SDF-1/CXCR4軸激活Wnt/β-catenin信號通路吸引角膜緣干細胞（LESCs和LNCs）至炎癥缺損部位定植、分化，修復缺損角膜，最終達到治療綠膿桿菌感染性角膜炎并恢復角膜結構功能的效果。

一、假說及機制示意圖

該水凝膠由季銨化超高脫乙酰殼聚糖（QUDCS）和氧化葡聚糖（OD）通過希夫堿反應形成，包封SDF-1。病損區快速原位成型后，水凝膠提供機械支撐，防止角膜穿孔，同時通過靜電破壞細菌膜和穿透生物膜發揮抗菌作用。持續的SDF-1釋放建立了趨化梯度，從角膜緣區域募集角膜緣上皮干細胞（LESCs）和角膜微環境細胞（LNCs），通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進組織再生（圖1）。

圖1 SDF-1/QUDCS/OD水凝膠體系及其治療綠膿桿菌角膜炎的機制示意圖

二、QUDCS/OD水凝膠合成及基本性能檢測

QUDCS由脫乙酰度99%的殼聚糖季銨化工藝合成。SEC-MALS分析證實其取代度為0.45、重均分子量維持在1.97×10?g/mol，1mg/mL溶液ζ電位為43.5±2.7 mV；醛基負載量為1.03mmol/g（羥胺滴定法驗證），1H NMR證實兩者化學改性成功。生理條件下，QUDCS與OD水溶液伯氨基與醛基形成動態亞胺鍵，無需外界刺激即可快速成膠。流變學測試顯示其力學性能具濃度依賴性，時間掃描證實快速成膠且形成穩定黏彈性網絡，QUDCS儲能模量為4.9~34.1 kPa，與人體角膜基質彈性模量（24~39 kPa）高度匹配；臨界應變達820%，遠超生理應變。累積釋放率顯示水凝膠在7天內表現出持續SDF-1釋放動力學，在24小時內初始爆發釋放35%，然后是穩定的零級釋放。體外降解實驗顯示，42天后，水凝膠質量逐漸損失達到60%，確保了暫時的機械支持，而不會引起長期的異物反應。

圖2 QUDCS/OD水凝膠的合成與表征。(A)QUDCS和OD在D2O中的氫核磁共振譜證實化學修飾成功。(B)QUDCS和OD之間的希夫堿交聯形成水凝膠的示意圖。(C)不同QUDCS濃度下的時間掃描和(D)頻率掃描（0.5-3wt%）。(E)應變振幅掃描。(F)交變應變試驗（1%/1200%）(G)自愈能力和可注射性的宏觀論證。(H)SDF-1的累積釋放曲線。(i)2mg/mL溶菌酶的酶降解動力學。(J)SEM顯微圖顯示多孔結構。

三、QUDCS/OD水凝膠的體外抗菌和抗生物膜效果

QUDCS通過膜破壞機制表現出與傳統抗生素不同的廣譜抗菌活性。該水凝膠對革蘭氏陽性（金黃色葡萄球菌和MRSA）和革蘭氏陰性（綠膿桿菌和大腸桿菌）細菌均顯示出有效的殺菌活性，其效果與QUDCS濃度直接相關。高分辨率掃描圖像顯示對照菌細胞表面光滑，形態完整。經QUDCS/OD處理后，細胞表面粗糙、膜起皺和細胞質滲漏。以銅綠假單胞菌為模型生物評估了水凝膠的抗生物膜功效。水凝膠顯示出雙重抗生物膜活性：防止初始生物膜的形成和破壞已建立的生物膜。結合有效的殺菌活性，對抗生素耐藥菌株的有效性，以及優越的生物膜根除，使QUDCS/OD水凝膠有望成為傳統抗菌藥物的替代品。

圖3 QUDCS/OD水凝膠的體外抗菌和抗生物膜效果。(A)不同濃度QUDCS/OD對金黃色葡萄球菌、MRSA、綠膿桿菌和大腸桿菌處理8小時后的細菌菌落。(B)菌落形成單位（CFU）定量測定細菌活力。(C)時間殺傷動力學。(D)細菌形態變化的SEM顯微照片。(E)對綠膿桿菌的生物膜形成抑制和(F)成熟生物膜根除效果。(G)掃描電鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡圖像顯示生物膜結構和活力（活/死染色：綠色=活細胞，紅色=死細胞）。定量分析(H)生物膜生物量、(I)生物膜蛋白含量、(J)多糖含量。

四、SDF-1/QUDCS/OD水凝膠治療細菌性角膜炎的療效觀察

SDF-1/QUDCS/OD水凝膠系統的轉化潛力通過臨床相關的綠膿桿菌角膜炎小鼠模型進行了評估。臨床評估顯示各治療組的治療反應呈雙期模式。在最初的48小時內，所有組都表現出相當的疾病嚴重程度，反映了以細菌增殖和宿主免疫激活為主的急性炎癥期。然而，從第3天開始，出現了不同的治療軌跡。與PBS對照組相比，QUDCS組、SDF-1/QUDCS/OD組、TOB組和TOB + SDF-1組的臨床表現漸進式改善（p < 0.05），從第5天開始，裝載SDF-1的水凝膠表現出更好的性能。這一時間特征表明，雖然即時抗菌活性提供了最初的疾病控制，但再生因子的持續釋放在緩解階段變得越來越重要。SDF-1/QUDCS/OD對角膜炎所展現的治療作用遠不止其抗菌活性，活躍的組織再生和減少角膜纖維化在本次研究中也進行了進一步的論證。SDF-1/QUDCS/OD的治療加速受損角膜再上皮化，抑制纖維化因子α-SMA的表達。H&E染色顯示SDF-1/QUDCS/OD的治療保留了正常的角膜結構，對照組表現出廣泛的結構破壞，包括上皮增生、間質水腫、多形核細胞浸潤和新生血管。小鼠前段光學相干斷層掃描（AS-OCT）圖像直觀地顯示了水凝膠在角膜表面的覆蓋和保留。單次給藥足以滿足小鼠角膜炎的整個治療周期，為感染性角膜炎的抗炎作用、組織修復和疤痕減少提供足夠的機械支持和最佳微環境。

圖4 SDF-1/QUDCS/OD水凝膠對綠膿桿菌角膜炎小鼠模型的治療作用。(A)眼前段照片（上排）和熒光素鈉染色。(B)定量臨床評分。(C)CFU細菌載量定量。(D)（α-SMA，紅色）免疫熒光染色。(E)角膜再上皮化完成時間。(F)第7天的組織病理學分析：H&E染色和馬森氏三色染色（（h =出血，f =纖維化，u =潰瘍，I =炎性細胞浸潤，e =水腫）。(G)小鼠前段光學相干斷層掃描（AS-OCT）圖像顯示了水凝膠（箭頭）在角膜表面的覆蓋和保留。

五、生物相容性評價

生物相容性也是評價生物材料的治療方法的臨床轉化的重要指標。本實驗中，我們通過體外和體內綜合方法系統地評估了SDF-1/QUDCS/OD水凝膠的安全性。其表現出來的細胞相容性，血液相容性及組織相容性均在安全閾值內。通過30天的連續觀察來探究水凝膠的遠期并發癥，小鼠的體重，血常規、生化指標和重要器官均未發現明顯改變。

圖5 SDF-1/QUDCS/OD水凝膠的體內外生物相容性評價。(A)永生化人角膜上皮細胞（iHCECs）和LESCs + LNCs的活/死熒光成像。(B)細胞活力的定量。(C)溶血試驗。(D) TUNEL檢測角膜組織切片細胞凋亡，H&E染色（f =纖維化，u =潰瘍，I =炎性細胞浸潤，e =水腫）。(E) ELISA檢測角膜組織勻漿中炎癥標志物IL-1 β、IL-1和TNF-α的表達水平。(F)30天后小鼠角膜眼前段照片和熒光素鈉染色。(G)30天小鼠主要臟器（心、肝、脾、肺、腎）H&E染色。(H)30天以上體重監測。血液及生化指標。

六、綠膿桿菌性角膜炎中SDF-1/CXCR4軸的時空動態分布

干細胞定向遷移到損傷部位，被稱為“歸巢”，代表了通過趨化因子受體相互作用介導的組織再生的基本機制。SDF-1/CXCR4軸的生物學功能與其時空分布特征密切相關。這種分布是動態的，而不是靜態的或均勻的，同時表現出時間變異性和空間極性。在病理條件下，SDF-1表達調節在內源性和外源性趨化因子傳遞系統之間表現出不同的動力學。SDF-1/QUDCS/OD水凝膠組顯示，從第3天開始，中央角膜的SDF-1水平迅速持續升高，超過了QUDCS對照組和角膜緣區域的水平。這種加速積累反映了外源性SDF-1通過水凝膠成功遞送和保留在損傷部位。相比之下，QUDCS組表現出延遲的內源性SDF-1上調，角膜中央水平僅在第9天接近角膜緣表達。這種時間延遲表明，僅靠抗菌治療不足以誘導最佳組織修復所需的快速趨化因子產生，特別是在綠膿桿菌感染性角膜炎中。表達CXCR4的細胞募集表現出不同的時間動態，盡管SDF-1快速積累，但CXCR4+細胞遷移表現出延遲動力學，這與趨化梯度建立和細胞反應所需的時間一致。SDF-1/QUDCS/OD水凝膠組在第6天顯示出大量CXCR4+細胞在角膜中央積聚，超過角膜緣水平，比QUDCS組早約3天。這種加速招募與外源性遞送SDF-1的梯度形成相關。這些發現表明建立有效的趨化梯度不僅需要足夠的趨化因子濃度，還需要適當的空間分布和時間穩定性。

圖6 綠膿桿菌角膜炎進展和治療過程中SDF-1/CXCR4軸的時空動態。(A)正常對照和未經治療的角膜炎小鼠角膜緣和中央角膜中SDF-1和CXCR4的免疫熒光定位。DAPI:藍色。(B)感染后3、6和9天，角膜中SDF-1表達的免疫組織化學（上）和免疫熒光（下）檢測。(C)SDF-1平均熒光強度的定量分析。(D)角膜中CXCR4分布。(E)CXCR4平均熒光強度定量。

七、SDF-1介導的角膜緣干細胞中Wnt/β-catenin信號通路的激活

我們進一步研究了這種再生反應的分子機制。免疫熒光證實了角膜緣原代干細胞的表型穩定。持續表達CXCR4，可有效響應SDF-1趨化信號。SDF-1在誘導LESCs和LNCs中顯示出強大的趨化性，在500ng/mL時產生最大反應，超過500ng/mL時沒有觀察到額外的遷移，表明受體飽和。用CXCR4抑制劑AMD3100阻斷后，SDF-1誘導的趨化性被消除。Wnt通路抑制劑DKK1顯著減弱SDF-1誘導的遷移而不影響基線運動，這為Wnt信號參與SDF-1介導的趨化提供了初步證據。SDF-1對角膜緣干細胞的增殖反應具有時間特異性，僅在治療72小時后才觀察到顯著效果，這種先趨化干細胞至損傷部位，后促進增殖的效應是生命體有序調節的體現，避免了干細胞的異常增殖導致腫瘤發生。Western blot分析的分子機制驗證顯示了經典Wnt通路的激活。SDF-1處理誘導了β-catenin的顯著核積累，這是Wnt通路激活的標志。進一步驗證GSK3βSer9的磷酸化增強，抑制了GSK3β的催化活性并阻止了β-catenin的降解。SDF-1對角膜緣干細胞的核轉運可被DDK1阻斷，證實了途徑的特異性。

圖7 SDF-1介導的LESCs和LNCs中Wnt/β-catenin信號的激活。(A)原代小鼠LESCs表達ΔNp63和ABCG2，LNCs表達Vimentin和SOX2的免疫熒光特性。兩種細胞類型都表達CXCR4(B)各處理組transwell圖像。(C)遷移細胞數定量。(D)免疫熒光顯示向下層遷移的細胞表達ΔNp63、ABCG2（紅色）、Vimentin和SOX2。(E)劃痕實驗。(F)創面愈合率量化。(G)細胞增殖動力學。(H)各處理組72h細胞活力。(I) Western blot分析顯示細胞核和細胞質β-catenin分布、p-β-catenin和p-GSK3βser9/總GSK3β表達。(J)不同處理條件下β-catenin（紅色）亞細胞定位的免疫熒光成像

八、總結

綜上，本研究開發了一種多功能水凝膠體系，將抗菌與組織再生相結合，為細菌性角膜炎提供了新的治療策略。基礎研究層面，證實了SDF-1/CXCR4軸通過激活Wnt/β-catenin信號通路介導干細胞的趨化和增殖，并詳細分析了SDF-1與CXCR4的時空分布模式，為深入理解干細胞調控和推進再生醫學提供了新見解。該研究緊扣臨床需求，多學科交叉創新，有望緩解我國角膜供體緊缺的現狀，為眼病精準治療與眼用生物材料研發提供新思路。

02

論文第一及通訊作者簡介

第一作者

耿雯：華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院眼科，博士后。研究方向為眼表及角膜疾病的基礎及臨床治療。

陸藝文：武漢大學化學與分子科學學院2022級博士研究生，研究方向為基于天然高分子的生物醫用材料。

通訊作者

張明昌：華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院眼科原主任、二級教授、主任醫師，博士生導師。湖北醫師協會眼科醫師分會主任委員，中華眼科學會委員兼全國角膜病學組委員，中國醫師協會眼科分會常委兼干眼及眼表疾病學組副組長，中國醫師協會顯微眼科專委會副主任委員，海峽兩岸醫藥協會眼科分會副主任委員兼淚液及眼表疾病學組副組長，中華預防醫學會公共衛生眼科分會委員，湖北省眼科學會第十屆主任委員兼角膜學組組長，武漢巿眼科學會第十四、十五屆主任委員，教育部高等院校眼視光指導委員會委員，亞洲干眼協會創始委員，中國醫學教育協會眼科分會常委，中國研究型醫院協會眼科分會常委，中國老年保健研究會眼科分會常委，中國裝備委員會眼科分會常委，中國康復技術及發展促進會眼科專委會常委，全國角膜病學組委員，國家兒童青少年視力健康管理專家咨詢委員，國家近視防控專家宣講團成員，湖北省眼與視力健康學會副主任委員，湖北省視力健康管理協會副主任委員。《Cornea》中文版副主編，中華眼科雜志等十余種雜志編委，中華眼科學會專家會員。國家重點研發計劃首席科學家，華中卓越學者。承擔國家科技重點專項、國家自然基金、湖北省自然基金重大項目等十余項課題，發表學術論文200余篇。于世界頂級醫學雜志《柳葉刀》發文1篇。國際上首先報道PTK聯合PRK手術、淚液脂質檢測試紙、瞼板腺體外器官培養新模型等。獲得湖北省科技進步一等獎，中國優秀眼科醫師獎、中華眼科創新獎，2018年中國最美眼科醫生，2021年中國影響力醫生及2022中國眼科年度人物，牽頭研發我國首臺全飛秒激光近視手術治療儀，獲得兩屆中國眼科年度十大進展。

蔡杰：武漢大學化學與分子科學學院教授，中南醫院兼職教授，博士生導師，國家自然科學基金優秀青年科學基金獲得者和國家級人才項目青年項目入選者，中國化學會高級會員。主要研究領域為纖維素、甲殼素/殼聚糖等高結晶天然聚多糖“綠色”新溶劑和新材料。主持和承擔國家自然科學基金委員會青年科學基金、面上項目、優秀青年科學基金、重點項目、國際（地區）合作與交流項目，科技部“973”、“863”項目，以及深圳市、湖北省和武漢市科技項目等。在Adv. Mater.、Angew. Chem. Int. Ed.、Adv. Funct. Mater.等刊物發表SCI論文100余篇。授權國際和中國發明專利30余項。獲國家自然科學獎二等獎（第三完成人）等獎勵和榮譽。任Elsevier出版社Giant期刊編委、高等學校化學學報和Chemical Research in Chinese Universities第一屆青年執行編委。現任中國化學會獎勵推薦委員會委員、中國化學會纖維素專業委員會副主任、中國生物材料學會海洋生物材料分會副主任、中國化學會高分子學科委員會委員、中國化學會應用化學學科委員會委員和湖北省天然高分子基生物醫用材料工程技術研究中心主任。

謝華桃：華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院眼科黨支部書記、副主任，主任醫師。擅長角膜與眼表疾病的精準診療，聚焦人工角膜及角膜修復新材料的研發與臨床應用。兼任中華醫學會眼科學分會青年委員、中國醫師協會眼感染學組委員、武漢市預防醫學會眼健康與疾病防治專委會副主任委員、海峽兩岸醫藥衛生交流協會眼表與淚液學組委員。主持或參與多項國家自然科學基金、國家重點研發計劃項目，發表論文40余篇，擔任十余種期刊編委/審稿人，獲湖北省科技進步一等獎。

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資助信息

該研究獲國家自然科學基金(82171025,82070934,52473101,52173105）、中央高校基本科研業務專項資金（HUST: 2019kfyXMBZ065; WHU: 2042023kfyq05）、湖北省重點研發計劃項目（2021BCA146）、武漢市協和醫院臨床研究基金項目（2021xhlcyj03）、中央地方科技發展指導專項資金（XZ202202YD0021C）資助。

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原文信息

Geng W, Lu Y, Xu H, Song Y, Liu S, Liu X, Cai J, Zhang M, Xie H. Engineering multifunctional chitosan-based hydrogels for integrated antimicrobial therapy and endogenous stem cell-driven tissue repair in infectious keratitis. Bioactive Materials 2026; 62: 569-86.