Advanced Science I 卡格列凈不止降糖：通過“腸菌-蜜二糖-GLO1”軸緩解糖尿病腎小球內(nèi)皮損傷！(秦貴軍/趙艷艷—鄭大一附院)

2026年5月21日，鄭州大學第一附屬醫(yī)院秦貴軍、趙艷艷團隊，聯(lián)合上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院、鄭州大學天健先進生物醫(yī)學實驗室及多家臨床中心，在Advanced Science（中科院1區(qū)，Journal Impact Factor=14.1）在線發(fā)表題為 “Canagliflozin Alleviates Diabetic Glomerular Endothelial Injury via Melibiose in a Microbiota-Dependent Manner” 的研究論文。該文于 2025年9月3日投稿，2026年4月12日修回，2026年5月21日接收。 期刊影響因子信息見 Wiley 期刊頁面。

該研究聚焦糖尿病腎病（DKD）中“白蛋白尿—腎小球內(nèi)皮損傷—腸道菌群代謝物”之間的聯(lián)系。作者在 85 例接受卡格列凈治療的 DKD 患者和 85 例對照患者中隨訪 26 周，發(fā)現(xiàn)卡格列凈不僅降低尿白蛋白/肌酐比值（UACR），還可重塑腸道菌群，顯著富集 Roseburia intestinalis，并提高血漿 蜜二糖（melibiose） 水平。動物實驗進一步顯示，卡格列凈可改善 DKD 小鼠腎小球內(nèi)皮窗孔結構、內(nèi)皮完整性及白蛋白尿；而抗生素清除腸道菌群后，這一保護作用明顯減弱，提示其腎臟保護效應具有菌群依賴性。

機制研究顯示，活 R. intestinalis 可促進蜜二糖生成，而蜜二糖能夠直接結合并激活 乙二醛酶1（GLO1），降低甲基乙二醛水平，進而抑制 AGE-RAGE 信號通路，減輕糖尿病狀態(tài)下的腎小球內(nèi)皮損傷。作者還通過 GLO1 過表達、敲低和內(nèi)皮特異性敲除實驗進一步證明，蜜二糖對腎小球內(nèi)皮的保護作用依賴于 GLO1。最后，一項 12 周探索性臨床研究顯示，補充蜜二糖前體 水蘇糖 可升高 DKD 患者血漿蜜二糖水平，并降低 UACR、循環(huán)甲基乙二醛、TNF-α 和 IL-6。

總體而言，該研究提出了卡格列凈發(fā)揮腎臟保護作用的一條新路徑：卡格列凈重塑腸道菌群，富集 R. intestinalis，促進蜜二糖生成；蜜二糖激活 GLO1 并抑制 AGE-RAGE 通路，從而保護腎小球內(nèi)皮并降低白蛋白尿。這一發(fā)現(xiàn)不僅拓展了對 SGLT2 抑制劑腎臟保護機制的理解，也為 DKD 早期干預提供了“腸-腎軸”方向的新思路。

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【摘要】

卡格列凈在降低血糖之外，還可減少糖尿病腎病（DKD）患者的白蛋白尿，但其具體機制尚不清楚。本研究納入接受卡格列凈治療的 85 例患者和 85 例對照患者，并隨訪 26 周，以探索腸道微生物組及其代謝物是否參與腎臟保護作用。結果顯示，卡格列凈可重塑腸道菌群，尤其富集 Roseburia intestinalis，并提高血漿蜜二糖（melibiose）水平。在小鼠中，卡格列凈可緩解腎小球內(nèi)皮損傷和白蛋白尿。糞菌移植、補充 Roseburia intestinalis 或給予蜜二糖，均可模擬類似保護效應。機制上，蜜二糖可結合并激活乙二醛酶 1（GLO1），降低甲基乙二醛水平，抑制 AGE-RAGE 通路，從而維持腎小球內(nèi)皮完整性。此外，口服蜜二糖前體補充劑可降低早期 DKD 患者的白蛋白尿。上述發(fā)現(xiàn)提示，腸-腎軸可能參與卡格列凈的腎臟保護作用，蜜二糖也可能成為 DKD 的潛在干預策略。

01

研究背景及科學問題

糖尿病腎病（DKD）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，也是全球終末期腎病的重要原因。持續(xù)性白蛋白尿是 DKD 的典型特征，反映了腎小球濾過屏障在結構和功能上的損傷。其中，腎小球內(nèi)皮損傷被認為是 DKD 發(fā)生發(fā)展中的早期且關鍵事件，會導致腎小球通透性增加，并促進白蛋白尿出現(xiàn)。盡管傳統(tǒng)治療已經(jīng)取得進展，DKD 進展的殘余風險仍然較高，這提示有必要開發(fā)能夠直接靶向早期腎小球內(nèi)皮功能障礙的新策略。

鈉-葡萄糖協(xié)同轉運蛋白 2 抑制劑（SGLT2i）卡格列凈已在 DKD 患者中顯示出明確的腎臟保護作用，可顯著降低白蛋白尿并延緩腎功能下降。值得注意的是，卡格列凈除了通過抑制腎臟葡萄糖重吸收發(fā)揮經(jīng)典作用外，還被發(fā)現(xiàn)可調節(jié)腸道葡萄糖代謝并重塑腸道菌群組成，從而影響宿主碳水化合物代謝。這種相互作用提示，腸-腎軸可能參與介導卡格列凈的治療獲益。近年來，腸道菌群被認為是 DKD 病理生理過程的重要參與者。腸道菌群可產(chǎn)生多種進入全身循環(huán)的代謝物，并直接影響腎臟細胞功能。由于腎小球內(nèi)皮持續(xù)暴露于血液循環(huán)，它可能是感知并響應腸源性代謝物的關鍵界面。

在多種腸道菌群來源代謝物中，碳水化合物類化合物是一類重要的生物活性分子，在宿主與菌群互作中發(fā)揮重要作用。蜜二糖是一種微生物來源的二糖，近年來因其潛在的抗炎、抗氧化作用以及益生元功能而受到關注。然而，蜜二糖及其他菌群來源碳水化合物在腎小球內(nèi)皮功能和 DKD 中的作用仍缺乏系統(tǒng)研究。

本研究旨在探討卡格列凈對 DKD 患者和 DKD 小鼠模型腸道微生物組及代謝組的調控作用，評估菌群來源代謝物對腎小球內(nèi)皮損傷的保護作用，并進一步鑒定其分子靶點。通過揭示參與卡格列凈抗蛋白尿效應的腸-腎軸互作，本研究為 DKD 靶向治療提供了新的認識。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點

卡格列凈重塑 DKD 患者腸道菌群，并改善 DKD 小鼠腎小球內(nèi)皮損傷

研究首先建立了一個多中心臨床隊列，包括接受卡格列凈治療的患者和未接受 SGLT2i 治療的對照患者。兩組基線糖化血紅蛋白（HbA1c）相近，但經(jīng)過 26 周治療后，卡格列凈組尿白蛋白/肌酐比值（UACR）顯著下降。16S rRNA 測序顯示，卡格列凈組 Chao1 指數(shù)沒有明顯差異，但 Simpson 指數(shù)升高，提示菌群均勻度增加；同時，腸道菌群整體結構也發(fā)生改變。在線性判別分析中，多種菌屬在兩組之間存在顯著差異，其中 Roseburia 與腎臟指標關系密切，尤其與 UACR 呈明顯負相關。

在 DKD 小鼠中，每日灌胃卡格列凈 8 周后，空腹血糖下降，體重增加，UACR、肌酐和血尿素氮（BUN）改善。組織學結果顯示，卡格列凈可減輕腎小球肥大、系膜基質沉積和基底膜增厚。透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）進一步顯示，卡格列凈可恢復腎小球內(nèi)皮窗孔結構。內(nèi)皮標志物 CD31 在 DKD 小鼠中降低，而卡格列凈治療后得到恢復。同時，卡格列凈上調緊密連接和內(nèi)皮完整性相關蛋白 ZO-1、OCLN 以及糖萼核心蛋白 SDC1，并降低損傷相關標志物 ET-1 和 ICAM-1。小鼠腸道菌群分析也顯示，卡格列凈增加 Roseburia 等有益菌群，使菌群結構更接近健康對照，并且 Roseburia 豐度同樣與 UACR 呈負相關。這些結果提示，腸道菌群，尤其是 Roseburia，可能參與卡格列凈對腎小球內(nèi)皮損傷的保護作用。

圖1：卡格列凈重塑 DKD 中的腸道菌群并改善腎小球內(nèi)皮損傷。（A）接受卡格列凈治療的 DKD 患者（CANA 組，n = 85）和對照患者（CON 組，n = 85）的臨床研究流程圖。研究在基線和干預后采集血液、尿液和糞便樣本。（B，C）卡格列凈治療患者（n = 85）和對照患者（n = 85）的 HbA1c（B）和 UACR（C）水平。（D）基于 Bray-Curtis 距離的主坐標分析（PCoA）顯示 CANA 組和 CON 組之間的腸道菌群組成差異。每個點代表一個樣本，紅色表示 CON 組，藍色表示 CANA 組。（E）采用線性判別分析效應量識別 CON 組和 CANA 組之間豐度差異顯著的菌群分類單元（LDA > 2，p < 0.05）。紅色和藍色分別表示在 CON 組和 CANA 組富集的菌屬。（F）Pearson 相關分析用于評估所選細菌相對豐度與臨床參數(shù)之間的關系。（G）卡格列凈干預實驗方案。雄性 DKD 小鼠接受 20 或 40 mg kg?1 卡格列凈或 PBS 灌胃 8 周，年齡匹配的非 DKD 對照小鼠給予 PBS。（H）小鼠 UACR 水平（n = 8）。（I）H&E、Masson 三色和 PAS 染色代表性圖像，顯示 DKD 相關腎小球病理改變。比例尺，20 μm。（J）TEM 和 SEM 代表性圖像，顯示 DKD 相關腎小球內(nèi)皮損傷。比例尺，500 nm。（K）基于 TEM 圖像對單位長度內(nèi)皮細胞窗孔密度進行形態(tài)計量學定量（n = 3）。（L）基于 SEM 圖像對內(nèi)皮細胞窗孔面積密度進行形態(tài)計量學定量（n = 3）。（M）腎小球免疫熒光代表性圖像，顯示 DKD 小鼠中 CD31（紅色）標記內(nèi)皮細胞，DAPI（藍色）標記細胞核。比例尺，50 μm。（N）DKD 小鼠腎小球 CD31 熒光強度定量分析（n = 3）。（O）腎臟中 ZO-1、ICAM-1、OCLN、SDC1 和 ET-1 蛋白的代表性免疫印跡結果（n = 4）。（P）基于 Bray-Curtis 距離的 PCoA 顯示 NC、DKD 和 CANA 組之間的腸道菌群組成。每個點代表一只小鼠（n = 8）；灰色、紅色和藍色分別表示 NC、DKD 和 CANA 組。（Q）采用線性判別分析效應量識別 NC、DKD 和 CANA 組之間豐度差異顯著的菌群分類單元（LDA > 2，p < 0.05）。（R）基于 16S rRNA 測序的小鼠 Roseburia 相對豐度（n = 8）。（S）NC、DKD 和 CANA 組中 Roseburia 相對豐度與 UACR 之間的線性回歸分析（n = 8）。數(shù)據(jù)以中位數(shù)和四分位間距（B、C）以及均值 ± 標準差（H、K、L、N、R）表示。統(tǒng)計分析采用 Mann-Whitney U 檢驗（B、C）和單因素方差分析（H、K、L、N、R）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns p > 0.05。

腸道菌群參與卡格列凈對腎小球內(nèi)皮損傷的保護作用

為了進一步驗證腸道菌群是否介導卡格列凈的保護作用，研究者在 DKD 小鼠中使用廣譜抗生素混合物（Abx）清除腸道菌群，再給予卡格列凈治療。抗生素預處理 2 周后，小鼠腸道菌群基本被清除。菌群清除對血糖沒有顯著影響，但部分削弱了卡格列凈引起的輕度體重增加。更重要的是，菌群清除明顯削弱了卡格列凈降低 UACR 的作用，并降低了其改善 DKD 小鼠腎小球內(nèi)皮損傷的效果。

隨后，研究者進行糞菌移植（FMT）實驗。來自接受卡格列凈治療或未治療 DKD 小鼠的糞便被移植至抗生素處理后的 DKD 受體小鼠。16S rRNA 測序顯示，受體小鼠與供體小鼠的腸道菌群結構幾乎完全重疊。移植來自卡格列凈治療小鼠的菌群后，受體小鼠空腹血糖下降，體重未受明顯影響，同時 UACR 和肌酐水平降低，BUN 未出現(xiàn)顯著變化。更重要的是，接受卡格列凈供體菌群的小鼠腎小球內(nèi)皮損傷明顯改善。這些結果進一步支持：卡格列凈重塑后的腸道菌群參與其腎小球內(nèi)皮保護作用。

圖2：腸道菌群參與卡格列凈對 DKD 小鼠腎小球內(nèi)皮損傷的保護作用。（A）實驗方案示意圖，顯示 DKD 小鼠（CANA）和抗生素混合物誘導的偽無菌 DKD 小鼠（Abx + CANA）接受卡格列凈（40 mg kg?1）治療 8 周。DKD 對照小鼠給予 PBS（DKD）。（B）小鼠 UACR 水平（n = 6）。（C）H&E、Masson 三色和 PAS 染色代表性圖像，顯示 DKD 相關腎小球病理改變。比例尺，20 μm。（D）TEM 和 SEM 代表性圖像，顯示腎小球內(nèi)皮窗孔結構。比例尺，500 nm。（E）基于 TEM 圖像對單位長度內(nèi)皮細胞窗孔密度進行形態(tài)計量學定量（n = 3）。（F）基于 SEM 圖像對內(nèi)皮細胞窗孔面積密度進行形態(tài)計量學定量（n = 3）。（G）腎臟中 ZO-1、ICAM-1、OCLN、SDC1 和 ET-1 蛋白的代表性免疫印跡結果（n = 4）。（H）糞菌移植（FMT）實驗方案。來自 DKD 和 CANA 供體小鼠的糞便上清液被移植到抗生素混合物誘導的偽無菌 DKD 受體小鼠體內(nèi)，持續(xù) 8 周。（I）基于 Bray-Curtis 距離的 PCoA 顯示供體小鼠（DKD 和 CANA 組）以及受體小鼠（FMT-DKD 和 FMT-CANA 組）之間的腸道菌群組成。每個點代表一只小鼠（n = 4）；紅色和藍色分別表示 DKD 和 CANA 供體，綠色和黃色分別表示 FMT-DKD 和 FMT-CANA 受體。（J–L）小鼠 UACR（J）、Cr（K）和 BUN（L）水平（n = 8）。（M）H&E、Masson 三色和 PAS 染色代表性圖像，顯示 DKD 相關腎小球病理改變。比例尺，20 μm。（N）TEM 和 SEM 代表性圖像，顯示腎小球內(nèi)皮窗孔結構。比例尺，500 nm。（O）基于 TEM 圖像對單位長度內(nèi)皮細胞窗孔密度進行形態(tài)計量學定量（n = 3）。（P）基于 SEM 圖像對內(nèi)皮細胞窗孔面積密度進行形態(tài)計量學定量（n = 3）。（Q）腎臟中 ZO-1、ICAM-1、OCLN、SDC1 和 ET-1 蛋白的代表性免疫印跡結果（n = 3）。數(shù)據(jù)以均值 ± 標準差表示（B、E、F、J–L、O、P）。統(tǒng)計分析采用單因素方差分析（B、E、F）和非配對雙尾 Student t 檢驗（J–L、O、P）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns p > 0.05。

活 Roseburia intestinalis 緩解 DKD 小鼠腎小球內(nèi)皮損傷

臨床和小鼠結果均顯示，卡格列凈可增加 Roseburia 豐度，并且該菌屬與 UACR 密切相關。為了進一步明確具體菌種，研究者分析了 16S rRNA 測序注釋出的兩個 Roseburia 菌種：Roseburia intestinalis 和 Roseburia inulinivorans。結果顯示，卡格列凈組中顯著增加的是 R. intestinalis，而不是 R. inulinivorans。即使校正其他降糖藥物使用情況后，這一增加仍具有統(tǒng)計學意義。同時，R. intestinalis 與 UACR 呈明顯負相關。定量 PCR 進一步證實，DKD 患者在卡格列凈治療后 R. intestinalis 增加，小鼠數(shù)據(jù)也呈現(xiàn)一致趨勢。

為了驗證 R. intestinalis 的功能作用，研究者給 DKD 小鼠補充活 R. intestinalis 或熱滅活 R. intestinalis。活 R. intestinalis 能夠成功定植于腸道，而熱滅活菌不能。活 R. intestinalis 可降低小鼠體重，但不影響空腹血糖；同時顯著降低 UACR、肌酐和 BUN，而熱滅活菌沒有類似作用。組織病理和電鏡圖像顯示，活 R. intestinalis 可改善腎小球損傷。腎臟蛋白分析進一步顯示，活菌組損傷標志物下降，而內(nèi)皮完整性相關標志物升高。這些結果提示，活 R. intestinalis 可通過維持腎小球內(nèi)皮狀態(tài)來降低白蛋白尿。

圖3：卡格列凈促進 R. intestinalis 富集，活 R. intestinalis 改善 DKD 小鼠腎小球內(nèi)皮損傷。（A）基于 16S rRNA 測序的 CON 組和 CANA 組 Roseburia 相對豐度。（B）基于 16S rRNA 測序的 CON 組和 CANA 組 R. intestinalis 相對豐度。（C）基于 16S rRNA 測序的 CON 組和 CANA 組 R. inulinivorans 相對豐度。（D）治療后 R. intestinalis 相對豐度與 UACR 之間關聯(lián)的線性回歸分析。（E，F(xiàn)）pre-CANA 和 post-CANA 組人糞便中 R. intestinalis 相對豐度（n = 30）（E），以及 DKD 和 CANA 組小鼠糞便中 R. intestinalis 相對豐度（n = 5）（F）。（G）R. intestinalis 干預實驗方案。SPF 級 DKD 小鼠每日一次口服無菌甘油（DKD）、活 R. intestinalis（Live R.i）或熱滅活 R. intestinalis（HK R.i），持續(xù) 8 周，劑量為每只小鼠每 0.2 mL 含 1 × 10^9 CFU。（H）Live R.i 和 HK R.i 組小鼠糞便中 R. intestinalis 相對豐度（n = 6）。（I，J）小鼠空腹血糖（I）和體重（J）水平（n = 6）。（K–M）小鼠 UACR（K）、Cr（L）和 BUN（M）水平（n = 6）。（N）H&E、Masson 三色和 PAS 染色代表性圖像，顯示 DKD 相關腎小球病理改變。比例尺，20 μm。（O）TEM 和 SEM 代表性圖像，顯示腎小球內(nèi)皮窗孔結構。比例尺，500 nm。（P）基于 TEM 圖像對單位長度內(nèi)皮細胞窗孔密度進行形態(tài)計量學定量（n = 3）。（Q）基于 SEM 圖像對內(nèi)皮細胞窗孔面積密度進行形態(tài)計量學定量（n = 3）。（R–W）腎臟中 ET-1（S）、SDC1（T）、OCLN（U）、ICAM-1（V）和 ZO-1（W）蛋白的代表性免疫印跡（R）及定量分析（n = 3）。數(shù)據(jù)以均值 ± 標準差表示（A–C、F、H–M、P、Q、S–W）。統(tǒng)計分析采用配對雙尾 Student t 檢驗（E）、非配對雙尾 Student t 檢驗（F、H）、雙因素方差分析（I、J）和單因素方差分析（K–M、P、Q、S–W）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns p > 0.05。

菌群代謝物蜜二糖緩解糖尿病腎小球內(nèi)皮損傷

考慮到菌群與宿主之間的交流很大程度上由生物活性代謝物介導，研究者采用超高效液相色譜廣泛靶向代謝組學，分析接受或未接受卡格列凈治療的 DKD 患者血漿代謝變化。正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）顯示，兩組代謝譜可明顯分離。由于飲食和微生物來源的碳水化合物在宿主-菌群互作中具有重要作用，研究者重點關注這類代謝物。在變化最顯著的代謝物中，腸道菌群來源的二糖蜜二糖在卡格列凈治療后顯著升高，并且與 UACR 呈最強負相關。此外，隊列中蜜二糖水平與 R. intestinalis 豐度呈正相關。

在 DKD 小鼠中，靶向代謝組學進一步證實，口服卡格列凈可顯著提高血漿蜜二糖水平。抗生素介導的菌群清除可消除這一效應，而 FMT 可使其恢復。活 R. intestinalis 定植可進一步升高血漿蜜二糖水平，而 PBS 或熱滅活菌則不能；體外培養(yǎng)的 R. intestinalis 也能釋放高于培養(yǎng)基背景水平的蜜二糖。進一步分析提示，β-果糖苷酶可能參與這一代謝過程。卡格列凈治療后，患者糞便中 R. intestinalis 來源 β-果糖苷酶基因表達顯著升高。研究者還構建了過表達 R. intestinalis 來源 β-果糖苷酶基因 gly32 的重組 E. coli MG1655gly32 菌株，結果顯示，與野生型相比，gly32 過表達菌株在培養(yǎng) 24 小時后產(chǎn)生蜜二糖的能力顯著增強。這些證據(jù)提示，蜜二糖可能是 R. intestinalis 來源的關鍵代謝物，并參與卡格列凈的腎臟保護效應。

為了評估蜜二糖在體內(nèi)的腎臟效應，研究者每日給予 DKD 小鼠蜜二糖灌胃 8 周。蜜二糖不影響空腹血糖，但可減少體重增加、降低白蛋白尿并改善腎功能。進一步觀察顯示，蜜二糖明顯減輕腎小球損傷，恢復內(nèi)皮窗孔結構，并維持腎小球內(nèi)皮完整性。與此一致，蜜二糖上調內(nèi)皮保護相關蛋白，并下調損傷標志物。這些獲益在高脂飲食（HFD）聯(lián)合鏈脲佐菌素（STZ）誘導的另一種糖尿病模型中也得到重復驗證。體外實驗顯示，在人腎小球內(nèi)皮細胞（HGECs）中，25 或 50 μM 蜜二糖可增強 ZO-1 和 OCLN 表達，抑制 ET-1 和 ICAM-1，并減少高糖誘導的活性氧（ROS）積累，同時不影響細胞活力。這些結果表明，蜜二糖能夠保護腎小球內(nèi)皮細胞，并緩解 DKD 背景下的內(nèi)皮功能障礙。

圖4：卡格列凈誘導的腸道菌群代謝物蜜二糖改善腎小球內(nèi)皮細胞損傷。（A）正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）顯示 post-CON 組（n = 85）和 post-CANA 組（n = 85）的代謝物分布。post-CON 組以紅色顯示，post-CANA 組以藍色顯示。（B）按 p 值篩選出的前 10 個差異代謝物的 Log2 倍數(shù)變化（log2FC），顯示 CON 組和 CANA 組內(nèi)治療前后比較。紅色和藍色分別表示 CON 組和 CANA 組。（C）Pearson 相關熱圖，用于評估所選代謝物相對水平與臨床參數(shù)之間的關系。（D）post-CON 和 post-CANA 組中蜜二糖與 R. intestinalis 相對豐度之間的線性回歸分析。（E）CANA 給藥后小鼠血漿中蜜二糖濃度（n = 7–8）。（F）偽無菌小鼠接受 CANA 后血漿中蜜二糖濃度（n = 6）。（G）偽無菌小鼠接受 FMT 后血漿中蜜二糖濃度（n = 8）。（H）給予 R. intestinalis 后小鼠血漿中蜜二糖濃度（n = 6）。（I）R. intestinalis 培養(yǎng)上清液中蜜二糖濃度（n = 4）。（J）pre-CANA 和 post-CANA 組人糞便中 R. intestinalis 來源 β-果糖苷酶的相對豐度（n = 30）。（K）野生型和 gly32 過表達 E. coli MG1655 菌株培養(yǎng) 24 小時后，上清液中蜜二糖濃度（n = 4）。（L）蜜二糖干預實驗方案。雄性 DKD 小鼠接受 0.5 或 1.0 g kg?1 蜜二糖或 PBS 灌胃 8 周，年齡匹配的非 DKD 對照小鼠給予 PBS。（M，N）小鼠空腹血糖（M）和體重（N）水平（n = 8）。（O–Q）小鼠 UACR（O）、Cr（P）和 BUN（Q）水平（n = 8）。（R）H&E、Masson 三色和 PAS 染色代表性圖像，顯示 DKD 相關腎小球病理改變。比例尺，20 μm。（S）TEM 和 SEM 代表性圖像，顯示 DKD 相關腎小球內(nèi)皮損傷。比例尺，500 nm。（T）基于 TEM 圖像對單位長度內(nèi)皮細胞窗孔密度進行形態(tài)計量學定量（n = 3）。（U）基于 SEM 圖像對內(nèi)皮細胞窗孔面積密度進行形態(tài)計量學定量（n = 3）。（V）腎小球免疫熒光代表性圖像，顯示 DKD 小鼠中 CD31（紅色）標記內(nèi)皮細胞，DAPI（藍色）標記細胞核。比例尺，20 μm。（W）DKD 小鼠腎小球 CD31 熒光強度定量分析（n = 3）。（X）腎臟中 ZO-1、ICAM-1、OCLN、SDC1 和 ET-1 蛋白的代表性免疫印跡結果（n = 4）。數(shù)據(jù)以均值 ± 標準差表示（E–I、K、M–Q、T、U、X）。統(tǒng)計分析采用單因素方差分析（E–H、O–Q、T、U、X）、非配對雙尾 Student t 檢驗（I、K）、配對雙尾 Student t 檢驗（J）和雙因素方差分析（M、N）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns p > 0.05。

蜜二糖直接結合 GLO1 并增強其酶活性

為了闡明機制，研究者在高糖條件下對蜜二糖處理的 HGECs 進行 RNA 測序。結果顯示，蜜二糖處理顯著降低糖尿病并發(fā)癥中經(jīng)典內(nèi)皮功能障礙驅動通路 AGE-RAGE 信號通路的富集。隨后，研究者檢測了 AGE-RAGE 信號通路下游關鍵因子 TNF-α 和 IL-6。結果顯示，蜜二糖顯著降低糖尿病小鼠血漿和腎臟 mRNA 中 TNF-α、IL-6 水平，也降低高糖處理 HGECs 培養(yǎng)上清液中的 TNF-α 和 IL-6。結合蜜二糖下調 ET-1 和 ICAM-1 的結果，進一步支持其對 AGE-RAGE 軸的抑制作用。

為了識別蜜二糖的直接靶點，研究者采用藥物親和反應靶點穩(wěn)定性（DARTS）聯(lián)合質譜分析，篩選出 72 個候選蛋白。考慮到 GLO1 可解毒甲基乙二醛，而甲基乙二醛是晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的前體，研究者將 GLO1 作為重點靶點。DARTS 和細胞熱轉變實驗（CETSA）提示，蜜二糖處理后 GLO1 的蛋白水解抵抗性和熱穩(wěn)定性增加。微量熱泳動（MST）進一步證實，蜜二糖可與 GLO1 直接相互作用，解離常數(shù) Kd 為 3.48 ± 0.43 μM。

功能上，蜜二糖在高糖條件下顯著增強 GLO1 酶活性，但不改變其蛋白表達。與此一致，HGECs 和糖尿病小鼠腎組織中的甲基乙二醛水平均下降。GLO1 過表達可緩解高糖誘導的腎小球內(nèi)皮損傷；相反，GLO1 敲低會降低其表達和酶活性，加重內(nèi)皮損傷，并削弱蜜二糖的保護作用。分子對接預測顯示，蜜二糖可能通過與 GLO1 的 R38、N104、E111、K157 和 M158 位點形成氫鍵結合。進一步突變實驗顯示，蜜二糖可恢復表達野生型、E111A、K157A 或 M158A GLO1 細胞中的 GLO1 活性，但不能恢復 R38A 或 N104A 突變體中的活性。這提示蜜二糖可能主要通過 R38 和 N104 位點與 GLO1 相互作用，從而發(fā)揮保護效應。

此外，研究者還評估蜜二糖是否也通過 GLO1 保護其他腎小球細胞。結果顯示，GLO1 在腎小球內(nèi)皮細胞中的表達高于足細胞和系膜細胞。在高糖條件下，蜜二糖同樣可緩解足細胞和系膜細胞損傷，但作用弱于 HGECs；當 GLO1 被敲低后，這種保護作用明顯減弱。上述結果提示，蜜二糖通過 GLO1 介導的保護機制可能存在于多類腎小球細胞中，但以內(nèi)皮細胞中的作用最為突出。

圖5：蜜二糖直接結合 GLO1 并增強其酶活性。（A）基于 HGEC 轉錄組數(shù)據(jù)，對糖尿病并發(fā)癥中 AGE-RAGE 信號通路進行基因集富集分析（GSEA）。（B）采用 DARTS 方法識別蜜二糖結合蛋白的流程示意圖。（C）DARTS 實驗代表性免疫印跡及定量結果，顯示蜜二糖與 GLO1 之間的結合（n = 3）。（D）CETSA 實驗代表性免疫印跡及定量結果，評估有無蜜二糖處理時不同溫度下 GLO1 的穩(wěn)定性（n = 3）。（E）微量熱泳動（MST）實驗顯示蜜二糖與 GLO1 的直接結合親和力。（F）HGECs 中 GLO1 酶活性（n = 3）。（G）HGECs 中甲基乙二醛水平（n = 3）。（H，I）小鼠腎臟中甲基乙二醛水平（n = 5–6）。（J–O）GLO1 過表達后，HGECs 中 GLO1（K）、ET-1（L）、OCLN（M）、ICAM-1（N）和 ZO-1（O）蛋白的代表性免疫印跡（J）及定量分析（n = 3）。（P–U）GLO1 敲低后，HGECs 中 GLO1（Q）、ET-1（R）、OCLN（S）、ICAM-1（T）和 ZO-1（U）蛋白的代表性免疫印跡（P）及定量分析（n = 3）。（V）GLO1 敲低后 HGECs 中 GLO1 酶活性（n = 3）。（W）蜜二糖與 GLO1 的分子對接。圖中展示結合構象概覽，以及與 R38、N104、E111、K157 和 M158 殘基相互作用的局部放大圖。（X）在 GLO1 敲低 HGECs 中重新表達 GLO1 野生型和點突變體后的 GLO1 酶活性（n = 3）。數(shù)據(jù)以均值 ± 標準差表示（C、F–I、K–O、Q–V、X）。統(tǒng)計分析采用單因素方差分析（C、F–I、K–O、Q–U）和雙因素方差分析（V、X）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns p > 0.05。

蜜二糖對腎小球內(nèi)皮的保護作用依賴于 GLO1

為了在體內(nèi)明確 GLO1 的作用，研究者首先利用內(nèi)皮特異性 Tie2 啟動子驅動的 AAV2/9 載體，在腎小球內(nèi)皮中過表達 GLO1。結果顯示，內(nèi)皮 GLO1 過表達不改變空腹血糖、體重或肌酐，但可降低白蛋白尿，并輕度降低 BUN；同時減少血漿 TNF-α 和 IL-6，限制腎臟甲基乙二醛積累，并改善腎小球內(nèi)皮損傷和功能障礙。這提示 GLO1 在抵御糖尿病性腎小球內(nèi)皮損傷中具有關鍵作用。

隨后，研究者構建內(nèi)皮特異性 GLO1 敲除小鼠，以進一步驗證 GLO1 是否介導蜜二糖保護作用。GLO1 缺失不顯著影響空腹血糖、體重、肌酐或 BUN，但會顯著增加白蛋白尿，并加重糖尿病小鼠腎小球內(nèi)皮損傷。更重要的是，與 GLO1fl/fl 小鼠相比，蜜二糖在 GLO1?/? 小鼠中無法降低白蛋白尿，也不能降低血漿 TNF-α、IL-6 和腎臟甲基乙二醛水平；其對腎小球內(nèi)皮損傷的保護作用也在缺乏 GLO1 時被消除。

為進一步闡明腎臟 GLO1 在蜜二糖效應中的作用，研究者使用 AAV2/9-TIE-mir30-mCherry 特異性敲低糖尿病小鼠腎小球內(nèi)皮細胞中的 GLO1。所得結果與 GLO1?/? 小鼠相似。因此，這些發(fā)現(xiàn)支持：蜜二糖對腎小球內(nèi)皮的保護作用依賴于腎小球內(nèi)皮細胞中的 GLO1。

圖6：蜜二糖對腎小球內(nèi)皮的保護作用由 GLO1 介導。（A）內(nèi)皮細胞特異性 GLO1 敲除小鼠實驗方案。雄性 GLO1fl/fl、cre?（GLO1fl/fl）小鼠和 GLO1fl/fl、cre+（GLO1?/?）小鼠喂養(yǎng)普通飼料（CON）或高脂飲食聯(lián)合 STZ 誘導糖尿病。糖尿病小鼠接受蜜二糖（1.0 g kg?1，MEL）或 PBS（DM）處理。（B）示意圖顯示 Cre 介導 GLO1 等位基因中位于第 2 外顯子兩側 loxP 位點之間的重組。重組導致第 2 外顯子被切除，從而生成 GLO1 敲除等位基因。（C）內(nèi)皮細胞特異性 GLO1 敲除小鼠基因分型。代表性瓊脂糖凝膠電泳圖顯示 6 種基因型：Cre? 和 Cre+ 分別與 GLO1+/+、GLO1fl/+ 和 GLO1fl/fl 等位基因組合，基因組 DNA 來自 4 周齡小鼠尾組織。（D，E）小鼠空腹血糖（D）和體重（E）水平（n = 6）。（F–H）小鼠 UACR（F）、Cr（G）和 BUN（H）水平（n = 6）。（I）H&E、Masson 三色和 PAS 染色代表性圖像，顯示 DKD 相關腎小球病理改變。比例尺，20 μm。（J）TEM 和 SEM 代表性圖像，顯示腎小球內(nèi)皮窗孔結構。比例尺，500 nm。（K）基于 TEM 圖像對單位長度內(nèi)皮細胞窗孔密度進行形態(tài)計量學定量（n = 3）。（L）基于 SEM 圖像對內(nèi)皮細胞窗孔面積密度進行形態(tài)計量學定量（n = 3）。（M–R）腎臟中 ET-1（N）、SDC1（O）、OCLN（P）、ICAM-1（Q）和 ZO-1（R）蛋白的代表性免疫印跡（M）及定量分析（n = 3）。（S–U）小鼠血漿 TNF-α（S）、血漿 IL-6（T）和腎臟甲基乙二醛（U）水平（n = 6）。數(shù)據(jù)以均值 ± 標準差表示（D–H、K、L、N–U）。統(tǒng)計分析采用單因素方差分析（F–H、K、L、N–U）和雙因素方差分析（D、E）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns p > 0.05。

蜜二糖前體在 DKD 患者中顯示潛在干預價值

最后，研究者開展了一項為期 12 周的探索性臨床研究，以評估蜜二糖用于 DKD 患者干預的潛在價值。由于食品級蜜二糖無法獲得，研究者采用美國 FDA 認可為一般認為安全（GRAS）的蜜二糖前體水蘇糖進行膳食補充，劑量為每日 2 次、每次 5 g。共有 19 例 DKD 患者完成研究，基線 UACR 為 30–1000 mg g?1，背景治療保持不變。水蘇糖顯著升高血漿蜜二糖水平，并降低 UACR、循環(huán)甲基乙二醛、TNF-α 和 IL-6。研究還觀察到 BMI、HbA1c 和尿酸輕度下降。DKD 小鼠模型中的結果也支持這一發(fā)現(xiàn)。總體來看，這些結果提示，蜜二糖可能具有用于 DKD 患者干預的潛在價值，但仍需更大樣本、隨機對照研究進一步驗證。

圖7：蜜二糖前體升高 DKD 患者血漿蜜二糖水平并減輕白蛋白尿。（A）接受水蘇糖治療的 DKD 患者（n = 19）臨床研究流程圖。研究在基線和干預后采集血液和尿液樣本。（B）水蘇糖治療患者血漿蜜二糖水平（n = 19）。（C）水蘇糖治療患者 UACR 水平（n = 19）。（D–F）水蘇糖治療患者血漿甲基乙二醛（D）、TNF-α（E）和血漿 IL-6（F）水平（n = 19）。每個點代表一個樣本，黑色和紅色分別表示治療前和治療后（B–F）。統(tǒng)計分析采用配對雙尾 Student t 檢驗（B、D–F）和 Wilcoxon 符號秩檢驗（C）。****p < 0.0001。

【貢獻】★★★★★

本研究通過系統(tǒng)性分析揭示，卡格列凈調節(jié)的腸道菌群在 DKD 干預中具有關鍵作用。尤其是 R. intestinalis 來源的蜜二糖可增強其蛋白靶點 GLO1 的活性，從而抑制 AGE-RAGE 信號通路，緩解腎小球內(nèi)皮損傷，并最終降低 DKD 個體的白蛋白尿。研究還進一步提示，口服蜜二糖前體在早期 DKD 患者白蛋白尿干預中具有潛在價值，體現(xiàn)出一定的臨床轉化意義。整體而言，這些發(fā)現(xiàn)加深了對 DKD 中腸-腎軸作用的認識，并為臨床緩解白蛋白尿提供了一個新的潛在干預方向。

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