動物模型 | 肺癌模型及其應用

肺癌作為全球腫瘤發病率和死亡率最高的癌種，一直備受醫療界研究者們的廣泛關注。

肺癌主要分為非小細胞肺癌（non small cell lung cancer, NSCLC）和小細胞肺癌（small celllung cancer, SCLC），前者主要包括腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌;其中非小細胞肺癌約占肺癌的80~85%，其中肺癌動物模型已逐漸成為其機制研究及藥物研發必不可少的工具。

表1：2020年中國癌癥新發病例數前十的癌癥類型

表2：肺癌類型

常見肺癌模型

肺癌模型主要分為CDTX肺癌細胞移植模型（皮下移植模型和原位移植模型），PDTX（人源腫瘤組織異種移植模型）和基因修飾的肺癌模型，下面依次介紹。

一. CDTX（肺癌細胞移植模型）

肺癌模型中，根據接種部位主要分為皮下和原位移植模型，在這類模型中需要選擇正確的肺癌細胞株，可以參考上表中肺癌細胞分類，并根據實驗目的選擇正確的荷瘤模型，如皮下荷瘤主要用于單獨研究腫瘤生長情況。

1、 皮下荷瘤

定義：根據研究的肺癌類型及基因突變情況，選取狀態好的腫瘤細胞移植于小鼠皮下。例如，我們研究KRAS突變的肺癌，通常選取KRAS突變的A549細胞，細胞量為1×106－3×106/只。

2、原位荷瘤

定義：將腫瘤細胞通過注射等方式移植到模式動物肺部構建的動物模型。

模型優點：與皮下荷瘤模型相比，能更好反映腫瘤在人體內的一個發生發展及轉移過程。

實驗操作方法：

① 細胞系選擇及準備工作

為了便于觀察肺癌細胞在體內生長情況，選用帶熒光素酶（Luciferase）標簽的A549細胞，取對數生長期的A549-Luc（106/只）用胰酶消化收集，1×PBS洗兩次，用PBS重懸后與生長因子減少的Matrigel基質膠按1:1的比例混合，每只老鼠注射100μl含1×106個細胞的混合懸液；

② 小鼠的準備工作

選取6-8周齡的Balb/c無胸腺裸鼠，置于超凈工作臺中麻醉，裸鼠由興奮狀態轉為麻醉狀態后將其以右側臥位固定，胸腔表面用酒精消毒。

③ 切口位置的選取，確定肺部位置

確定位置：位于小鼠左側肋弓下緣以上約1cm處（第四、五肋弓之間），這一部位有兩條縱向較粗的血管，肺部位于這兩條血管之間（視頻中用黑色marker筆標注位置）。

露出肺部：先將表皮剪一約5mm的小口，沿此小口逐步剪開下層皮下及肌肉組織，隔著胸膜可以看到粉色的肺部，肺部會隨著小鼠的呼吸收縮和擴張。

④ 腫瘤細胞注射

取混勻的100μl的細胞懸液，沿著切口對準小鼠的左肺緩慢注射，進針深度約為3mm，注射結束后停針5s，左右旋轉慢速出針。

⑤ 小鼠傷口縫合

將剪開的小鼠表皮進行縫合，將小鼠以右側臥位（使傷口朝上）置于37℃恒溫加熱板上直至小鼠蘇醒，放回原籠中繼續飼養，4-6天傷口即可愈合。

注意事項：

① 為什么使用Matrigel？

如果腫瘤細胞僅用PBS重懸便注射到小鼠肺部，細胞可能隨肺部氣管快速擴散，造成氣管堵塞導致小鼠死亡，使用Matrigel與細胞混合后進行實驗便可降低小鼠死亡風險。

② 如何避免出血？

操作過程中要避開較粗的血管，以免流血影響后續實驗操作以及肺部的觀察；并且最好選用胰島素注射器，由于注射器針頭扎入肺部有可能損傷肺部大血管，很容易造成小鼠的死亡，因此注射器最好選用針頭較細的胰島素注射器。

③ 注意整個操作過程及手術器械要保持無菌，以免小鼠感染。

④ 后續分組和試驗分析

分組時間：一般原位注射一周后，裸鼠肺癌原位模型建成，進行分組（n=10）；

如何分組：依據裸鼠體重腹腔注射相應劑量的D-luciferin (Xenogen) 熒光底物（150 mg/kg），將裸鼠放置于麻醉箱中通以2.5%異氟烷/氧，待裸鼠麻醉后轉入IVIS廂室中，使其腹面朝下并持續通以麻醉氣體，注射底物10min后，進行熒光成像，測量各裸鼠肺部初始熒光值，依據熒光值的大小平均分組。隨后可進行給藥等實驗，定期進行熒光檢測。

倫理：動物倫理學規定，小鼠腫瘤重量不可超過小鼠體重10%，平均腫瘤直徑不超過20mm，并且如果出現潰爛，并且嚴重轉移，造成感染或壞死時，應該中止實驗且對動物施行安樂死。

二. PDTX（人源腫瘤組織異種移植模型）

定義：將病人肺癌組織移植到小鼠皮下等部位，主要用于抑制腫瘤生長（細胞增殖）的藥物的篩選檢測，在近年該模型越來越受重視。

模型優點：因為取自病人的腫瘤組織，在組織形態和遺傳特征等方面均與人類腫瘤相同，故這種模型可以更貼近人類腫瘤的生物學特性。

實驗操作方法：

① 處理新鮮肺癌組織：在無菌條件下的冰上對新鮮離體的肺癌腫瘤組織，剔除包膜及壞死組織，切成約15mm3（2mm×2mm×3mm）的小塊；

② 首次接種小鼠：將切好的組織碎片用鑷子填入定制的套管針尖端內，注射到5-6周NOD/SCID重癥聯合免疫缺陷小鼠背部皮下，每只老鼠背部可以接種1-2個位點，每例腫瘤接種2-3只小鼠，此接種過程須在腫瘤標本離體后2h之內完成，為提高成瘤率腫瘤塊也可混合10% Matrigel進行荷瘤；

③ 再次傳代：當裸鼠皮下腫瘤生長至1000 mm3左右，表示移植成功，對其處于對數增長期的原代（F1代）皮下移植小鼠模型進行傳代。

④ 剝離皮下腫瘤，部分組織速凍至液氮備用或經4%多聚甲醛固定后石蠟包埋；另一部分組織按照上述接種步驟，移植到4-5只裸鼠皮下，建立第二代移植小鼠模型（F2代）。按照此流程，在裸鼠體內連續傳代3代后，移植瘤的生長速度開始穩定，可進行體內動物模型實驗。

基因修飾模型

定義：主要是利用基因編輯技術如CRISPR/Cas9進行敲除或插入特定基因，從而誘發動物產生腫瘤的模型。肺癌基因修飾模型主要是KRAS突變誘導肺癌等產生，KRAS突變同時P53缺失會加速腫瘤的發生發展。

模型優點：主要用于腫瘤發生發展過程及作用機制的研究；同時原癌基因的頻發突變是腫瘤產生的重要原因之一，因此靶向這部分原癌基因的抗腫瘤藥物篩選是一個重要方向。

構建方法：

可以參考基因編輯小鼠構建過程（包括KO,KI,CKO小鼠的構建等）

一. 非小細胞肺癌模型

非小細胞肺癌主要包含腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞肺癌，還包含不太常見的類型例如腺鱗癌和肉瘤樣癌。在非小細胞肺癌中，發現很多驅動突變，常見的驅動突變包括Kras突變、EGFR突變、FGFR1擴增、ALK重排、HER2突變、MET擴增、BRAF突變等。

研究人員對肺癌的多個突變進行探究，將肺癌中發現的突變進入引入到小鼠中，從而獲得多種用于研究肺癌發生與轉移機制、篩選和評價抗腫瘤藥物的肺癌模型。

表3：非小細胞肺癌中基因突變頻率和類型

1. KRAS突變肺癌模型

野生型KRAS激活/失活效應是受控的，而突變型KRAS蛋白功能異常，持續處于激活狀態，導致腫瘤細胞的持續增殖。KRAS突變的腫瘤細胞比其他腫瘤細胞更容易存活，因此KRAS突變的肺癌治療也一直是醫學界的一個難題。

目前國際上應用最廣泛的肺癌動物模型就是KRAS-LSL-G12D小鼠模型，可以通過與肺上皮細胞特異性的Cre轉基因小鼠雜交來實現KRAS突變體的激活，從而導致肺癌的發生。有研究表明，通過SPC-Cre小鼠與KRAS-LSL-G12D小鼠雜交，從而獲得了從肺部炎性反應到肺腺瘤進展時程較長的慢性自發肺部腫瘤小鼠模型。KRAS-G12D誘導的肺癌模型為肺癌病因的研究提供了更長的窗口期，也為Kras突變的肺癌治療提供了更有力的研究工具。

KRAS-LSL-G12D還經常和其它癌癥驅動基因聯用，用來滿足更多的肺癌研究需求。

在人類NSCLC中經常發現KRAS-G12D突變和Lkb1缺失同時出現，而小鼠中KRAS- G12D突變伴隨Lkb1缺失會加速肺腫瘤發展，惡性程度也會更高，出現多樣的表型特征，包括鱗狀細胞癌和大細胞癌。KRAS-G12D突變并發激活Wnt /β-Catenin信號會增加侵襲性和遠端組織感染。KRAS-G12D突變伴隨p53失活導致侵襲性增加，也發生轉移現象，這可能是p53的缺失導致基因組的不穩定，從而導致腫瘤惡性化。

2. EGFR突變肺癌模型

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在細胞增殖和分化中起到重要作用，是目前最重要的靶向治療靶點之一。

突變后導致蛋白功能異常，持續處于激活狀態，導致腫瘤細胞的持續增殖。針對其敏感突變的EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKI），是治療NSCLC最常用的靶向藥物，EGFR-TKI療效好和副作用少，為很多肺癌患者帶來希望，是肺癌治療中的突破性進展。

但是靶向治療也有其自身的弊端，幾乎所有的EGFR-TKI治療患者最終均產生獲得性耐藥：第一代和第二代靶向藥治療后出現T790M耐藥性突變，第三代靶向藥治療后出現C797S耐藥性突變。由此催生了多種攜帶耐藥性突變的EGFR肺癌模型，可用于新藥的研發和腫瘤耐藥性的研究因此目前也有很多EGFR突變的肺癌腫瘤，用于新藥的研發以及腫瘤耐藥性研究。

和KRAS-G12D突變引起的局灶性腫瘤不同，EGFR-L858R突變引起的是類似于支氣管肺泡的彌漫性腫瘤，EGFR外顯子19的缺失引起多灶性腺癌。

并且研究發現，EGFR-T790M突變小鼠以及EGFR-L858R+T790M突變小鼠比EGFR-L858R突變小鼠的腫瘤潛伏期要更長，適用于耐藥性機制研究。

3. ALK基因重排肺癌模型

ALK編碼酪氨酸受體，在正常肺中不表達，但是在約5％的非小細胞肺癌患者中會表達EML4-ALK，EML4-ALK是由于染色體倒位形成EML4基因與ALK 基因的重排，EML4-ALK的表達促使肺癌發生和惡化，是目前的靶向治療的熱門靶點之一。EML4-ALK融合常見于年輕患者以及輕度吸煙或不吸煙者，并且EML4-ALK與KRAS以及EGFR突變相互排斥，基本不同時出現。

研究表明，肺特異性表達EML4-ALK的小鼠出生后不久發生多發性肺腺癌，為研究ALK靶向抑制劑（ALK-TKI）的敏感性以及耐藥性提供合適模型，并且也為ALK-TKI的臨床前藥物篩選提供有力工具。

4. 其它肺癌模型

除了以上3類小鼠模型，還有其他基于驅動突變導致的肺癌研究模型，如PIK3CA-H1047R突變小鼠可發生具有支氣管肺泡特征的腺癌，BRAF-V600E突變小鼠可發生腺瘤（很少進展為腺癌）。

二. 小細胞肺癌模型

小細胞肺癌是一種侵襲性強、難以治療的癌癥類型，約占全部肺癌病例的13-15%。具有轉移速度快、惡性程度高、預后情況差等特征，屬于惡性程度極高內分泌腫瘤。

在小細胞肺癌中，最常出現的驅動突變是Rb和p53的基因功能缺失，因此SCLC動物模型中通常使用Rbflox小鼠，p53 flox小鼠和肺部特異性Cre小鼠進行交配獲得。

Rb和p53的同時特異性敲除后，SCLC的腫瘤發生率很高，并且腫瘤和人類腫瘤相似度很高，也能轉移到特定的組織，但是整個周期比較長，大約9個月。因此通常會加入一些其他突變基因加速腫瘤發生，例如Rb，p53和Ppten同時的組織敲除，Rb，p53和p130同時敲除，Rb和p53敲除同時過表Lmyc和Nfib，均可加速腫瘤發生。

肺癌免疫治療的潛在靶點

1. 基于T細胞的免疫調節

（A）與佐劑混合的疫苗可以利用MHC I類和II類肽復合物和共刺激信號，模仿專業抗原呈遞細胞與幼型T淋巴細胞之間的自然相互作用。

（B）被動免疫療法涉及轉移具有高親和力的離體擴增的T細胞，具有特定特異性的T細胞受體，或經過基因修飾以過表達嵌合抗原受體。

（C）單克隆抗體可與共刺激受體發生接觸或激動。

（D）鈍化或拮抗抑制性受體，導致T淋巴細胞過度刺激。

2. 影響癌癥免疫治療中的微環境

（A）重編程M2樣巨噬細胞包括驅動骨髓細胞成為使Th1淋巴細胞極化的殺傷細胞或抗原呈遞細胞。

（B）通過使用細胞毒性藥物可以誘導腫瘤細胞變得更具有免疫原性，這些細胞毒性藥物可增強腫瘤細胞對T細胞和自然殺傷細胞攻擊的敏感性，觸發內質網應激反應或自噬反應（促進T細胞啟動），或減少免疫抑制分子的表達或分泌。

（C）在淋巴瘤和白血病中，正在被動施用抗體，這些抗體橋接腫瘤細胞和T淋巴細胞并促進T細胞的逆轉錄和活化，導致腫瘤細胞死亡。

（D）抗體依賴性細胞毒性介導的抗體可以增強自然殺傷細胞，中性粒細胞和巨噬細胞的功能，有利于腫瘤細胞的死亡和免疫成分的激活。IDO=吲哚胺2，3-二加氧酶。

3. 非小細胞肺癌的免疫逃生和逃避機制

腫瘤細胞最終失去MHC I類或I類分子（如NKG2D配體）和腫瘤相關抗原，使其對細胞毒性T淋巴細胞攻擊具有抗性。同時，它們分泌免疫抑制細胞因子或趨化因子，通過招募免疫抑制劑（例如調節性T細胞，骨髓來源的抑制細胞和未成熟的樹突狀細胞）來防止T細胞啟動。由于癌基因成癮或適應性免疫抵抗，它們還表達PD-L1和PD-L2抑制分子，促進T細胞無能或疲憊。

4. 非小細胞肺癌的推定組合免疫治療和化療方案

（A）大多數NSCLC療法并非旨在引起免疫系統對腫瘤殺傷活動的貢獻，從而排除了保護性記憶，抗癌T細胞免疫的可能性。

（B）將這些方面結合到癌癥治療中應考慮以下幾點：誘導免疫原性細胞死亡過程，添加代償性療法（例如在缺乏HMGB1的腫瘤中使用TLR4或MYD88激動劑，使用基于順鉑的療法的內質網狀應激源，或在缺乏自噬的腫瘤中使用外胚層ATP酶抑制劑），恢復免疫抑制（通過使用作用于免疫檢查點的單克隆抗體或M2的重編程）， 并在疾病得到控制時使用佐劑疫苗提高記憶T細胞反應或創建更廣泛的T細胞庫。

（C）這種組合方案應以協同方式將腫瘤和宿主反應聯系起來。