T細胞銜接器的設計：活性與安全性的平衡策略

引言

T細胞是抗腫瘤免疫的核心效應細胞，可通過識別主要組織相容性復合體（MHC）分子呈遞的抗原肽直接清除腫瘤細胞。然而，能夠介導有效腫瘤殺傷的腫瘤特異性T細胞庫通常受限，而腫瘤微環境（TME）中的大多數T細胞是腫瘤非依賴性的旁觀者T細胞。因此，將旁觀者T細胞重定向至腫瘤細胞的策略已成為基于T細胞的免疫治療的重要方向。

TCEs是同時結合T細胞和腫瘤細胞的雙特異性抗體，其中大多數靶向CD3，以招募廣泛的T細胞，以抗原非依賴的方式介導腫瘤細胞殺傷。臨床實踐中，TCEs在血液系統惡性腫瘤中已展現出顯著療效，特別是針對CD19、CD20和BCMA等B細胞抗原的相關疾病。此外，通過靶向DLL3和gp100等靶點，TCEs在特定實體瘤中也顯示出令人鼓舞的活性。迄今為止，已有12種TCEs獲得批準，包括2017年撤回、2025年重新獲批的卡妥索單抗，另有5種TCEs已進入III期臨床評估。

一、TCEs實現T細胞活化的控制因素

類似于單克隆抗體，TCEs通常通過靜脈或皮下途徑給藥。盡管全身給藥能夠有效靶向血液系統惡性腫瘤中的抗原，但實體瘤固有的物理屏障顯著限制了藥物的滲透和瘤內分布。因此，TCEs在實體瘤中的治療療效從根本上由其在腫瘤部位的暴露特征決定，包括藥物的定位和持續存在。與此同時，正常組織中的非腫瘤暴露仍然是毒性的關鍵驅動因素。

抗CD3親和力

T細胞受體（TCR）-CD3八聚體復合物由異二聚體TCR（α/β或γ/δ）和六個CD3鏈（ε/γ、ε/δ、ζ/ζ）組成。功能上，TCR識別肽-MHC復合物并通過CD3轉導信號，觸發T細胞活化。CD3，尤其是CD3ε，已成為TCE設計的首要靶點，因為它既能放大活化信號，又能防止過度活化。有效的CD3磷酸化對于TCE介導的T細胞活化至關重要，并且該過程高度依賴于TCE對CD3的親和力。然而，優化CD3親和力面臨著關鍵難題：過高的親和力可能觸發非靶依賴的T細胞活化，增加全身性細胞因子釋放并加速T細胞耗竭，而親和力不足可能無法在免疫抑制的TME中誘導強效的T細胞活化。找到恰當的平衡對于最大化腫瘤殺傷同時最小化細胞因子介導的毒性至關重要。

對于某些高親和力抗CD3 TCEs，即使在低劑量下T細胞活化和細胞因子釋放也可能發生。雖然降低CD3親和力是通過減輕細胞因子釋放來拓寬治療窗的直接方法，但許多臨床使用的TCEs以中等親和力和單價方式結合CD3。由于完全T細胞活化通常需要靶點介導的交聯，簡單的親和力降低可能損害腫瘤殺傷。這里提出一種更精細的策略，稱為“動力學調節”，即通過增加koff同時相應增加kon來維持平衡親和力Kd。這種方法可能減少外周CD3占用的持續時間，從而最小化非靶向啟動和T細胞的不期望遷移行為，同時維持足夠進行細胞毒性的瞬時相互作用。因此，親和力優化不僅應考慮T細胞活化，還應考慮結合動力學如何調節體內藥理學，整合藥效學和藥代動力學考量以實現更安全、更有效的TCE設計。

整合額外活化信號

T細胞活化遵循經典的三信號模型，包括TCR-pMHC結合（信號1）、共刺激（信號2）和細胞因子信號（信號3）。TCE結合CD3傳遞信號1，這是完全活化的必要但不充分條件。由共刺激受體介導并由免疫檢查點調節的信號2同樣至關重要。由于TCE誘導的T細胞擴增需要超越CD3連接本身的輸入，將信號2整合到TCE設計中已成為增強T細胞效應功能和整體治療活性的關鍵策略。

共刺激受體，包括CD28、4-1BB（CD137）、CD2和ICOS（CD278），在增強T細胞活化中發揮關鍵作用。其中，CD28通過與抗原呈遞細胞（APCs）上的CD80或CD86結合來提供信號2。盡管CD28可作為CD3的替代活化模塊，但其在靜息和活化T細胞上均有表達，這意味著僅結合CD28的TCEs可能面臨加速T細胞耗竭和過度炎癥性細胞因子釋放的風險。相比之下，4-1BB通常被認為是一種更安全的共刺激靶點，因為其表達是可誘導的，且主要限于活化T細胞，其信號傳導依賴于持續的抗原驅動刺激。此外，4-1BB信號促進記憶T細胞亞群的擴增，這一特點可用于4-1BB靶向的TCEs以擴大抗腫瘤免疫。

在實體瘤中，免疫檢查點分子，特別是程序性細胞死亡蛋白1及其配體PD-L1，通常通過抑制CD8? T細胞的細胞毒性來介導免疫逃逸。抗體介導的阻斷可以部分逆轉T細胞耗竭并恢復CD8? T細胞功能。將檢查點抑制整合到TCEs中可能進一步增強這些效應并對抗免疫抑制。

TCE傳遞的信號1與天然TCR產生的信號有著根本區別，TCE介導的單獨信號1通常不足以維持強效的T細胞活化的。為解決此限制，可將細胞因子納入TCE設計以提供信號3，從而支持T細胞增殖、分化和存活以延長持續存在。例如，白細胞介素-2直接結合T細胞上的IL-2受體以增強這些功能。

受體介導的T細胞亞群招募

傳統的CD3靶向TCEs最初是為招募細胞毒性T淋巴細胞進行腫瘤清除而開發的。由于CD3在所有T細胞譜系中表達，這些TCEs不加區分地活化的CD8?和CD4? T細胞。這種非選擇性活化的可能導致免疫抑制性調節性T細胞的招募，以及CD4? T細胞的活化，這是導致細胞因子釋放綜合征的主要因素。因此，對選擇性靶向特定T細胞亞群可以改善活性和安全性。

二、工程化TCE的設計考慮

腫瘤抗原選擇

目前，大多數TCEs靶向腫瘤相關抗原，這些抗原在惡性腫瘤中過表達，但在正常成人組織中通常保留可檢測的表達。盡管腫瘤特異性抗原在理論上更具優勢，但TAAs由于具有更廣泛的充分表征靶點庫，仍然是臨床開發的主要支柱。這一策略在血液系統惡性腫瘤中特別成功。所有已獲批或正在臨床開發的TCEs中，約26%靶向三種TAAs——CD19、CD20和BCMA，凸顯了它們近乎理想的靶點地位。CD20在B細胞和非霍奇金淋巴瘤中高表達，但在造血干細胞和漿細胞中不表達。同樣，CD19在B細胞譜系中廣泛表達，而BCMA特異于漿細胞，在HSCs或大多數非造血組織中不表達。關鍵在于，B細胞的再生能力進一步降低毒性風險。

實體瘤中的靶點選擇更具挑戰性，候選抗原常常在重要正常組織中共同表達，且免疫抑制性TME進一步要求強效的TCE活性。迄今為止，僅有兩種TCEs獲得FDA批準，包括tarlatamab用于小細胞肺癌和tebentafusp用于葡萄膜黑色素瘤。DLL3是Notch通路中的抑制性配體，在SCLC和其他神經內分泌腫瘤中高表達，在大多數正常組織中表達極少。盡管在某些腦區可檢測到，但OTOT毒性因TCEs穿越血腦屏障的能力有限而得到緩解。同樣，gp100是一種譜系限制性抗原，主要在黑色素細胞和黑色素瘤中表達，具有高組織特異性和有利的安全性特征。

總之，抗原選擇需要多因素的平衡。特異性本身是不夠的；腫瘤細胞表面的抗原密度也是TCE活性的關鍵決定因素，控制著免疫突觸形成的概率、重定向T細胞的活化的閾值和整體抗腫瘤細胞毒性。因此，在某些情況下，高表達的TAAs可能優于低密度的TSAs。最佳抗原選擇需要在腫瘤特異性與抗原豐度以及有效T細胞結合所需活性之間取得平衡。此外，理想的腫瘤抗原通常與惡性表型存在功能聯系，從而降低通過抗原突變或丟失實現免疫逃逸的風險。

通過價態和親和力調節優化

調節分子格式，特別是價態，為增強腫瘤細胞上的功能性親和力提供了主要途徑。例如，mosunetuzumab是一種異源二聚體1+1 IgG格式TCE，于2022年獲批用于NHL和MM。相比之下，glofitamab于2023年獲批用于DLBCL，采用異源二聚體“2+1”格式，具有兩個CD20結合臂和一個CD3結合臂。這種雙價腫瘤結合增加了在腫瘤細胞上的功能性親和力，從而增強了T細胞重定向和細胞毒性。臨床前研究報告稱，glofitamab的體外細胞毒性比傳統IgG形式增強了約40倍。這種高親和力設計還有助于在低抗原密度條件下維持活性。臨床上，glofitamab聯合標準化療在3期STARGLO試驗中實現了25.5個月的中位總生存期。增加價態的類似策略包括基于IgM的TCEs。天然IgM抗體通過五聚體或六聚體組裝（10或12個結合位點）實現高功能性親和力，盡管單個位點親和力相對較低。Imvotamab是一種工程化IgM格式TCE，包含十個高親和力抗CD20臂和一個通過J鏈融合的單抗CD3臂。它目前正在I-II期試驗中進行評估。

相比之下，親和力調節提供了一種增強腫瘤選擇性的替代方法。例如，一種含有兩個低親和力抗HER2 Fab臂的抗HER2×CD3 TCE，使其能夠優先靶向高HER2表達的腫瘤細胞，同時避免正常組織低水平表達。更廣泛地說，調節親和力和價態可以利用抗原密度閾值來改善選擇性。靶向同一TAA內的不同表位可能進一步細化這種效果。

具有AND/OR門控的雙TAA靶向TCE設計

當單個TAA無法提供足夠的結合親和力或腫瘤選擇性時，雙重靶向策略提供了有效的替代方案。這類TCEs根據藥理學意圖分為兩類：OR門控和AND門控設計。OR邏輯TCEs配置為使任一抗原的結合足以觸發生產性T細胞活化的。因此，每個腫瘤結合臂必須保留足夠的固有親和力和功能活性。在這種情況下，OR設計有助于減輕抗原異質性并減少由抗原陰性克隆生長引起的復發。例如，已開發了一種靶向CD19×CD22×CD3的三特異性TCEs，以減少與抗原丟失相關的免疫逃逸。

相比之下，AND邏輯TCEs被設計為優先在共表達兩種靶抗原的細胞上活化的T細胞。這通常通過使用較低親和力的單個結合子來實現，使得在雙陽性情境中通過協同親和力實現有效積累和突觸形成。AND邏輯設計非常適合實體瘤，因為候選抗原通常與正常組織共享，且精確區分至關重要。這里，降低的單價親和力最小化了與單陽性正常細胞的生產性結合，而雙抗原共表達驅動了親和力依賴的滯留和強效的T細胞重定向。例如，靶向EGFR×EpCAM×CD3的三特異性TCEs在體外對雙陽性腫瘤細胞的細胞毒性比單陽性細胞高約100倍。AND邏輯TCEs也可能在血液系統惡性腫瘤中具有潛力。ISB 2001在臨床前研究中顯示出比單靶向TCEs（如teclistamab）更優的骨髓瘤細胞殺傷，目前正在復發/難治性MM的I期試驗中進行評估。通過同時靶向同一腫瘤抗原上的多個表位——一種特殊形式的AND邏輯TCE——可以進一步增強腫瘤選擇性。例如，BR115同時結合HER2 ECD2和HER2 ECD4以及CD3，已進入I期臨床評估。

總體而言，OR和AND邏輯不僅在親和力調節上不同，在其潛在機制上也不同。OR門控主要解決抗原異質性，這在靶抗原分布在部分重疊的腫瘤細胞群體中時尤為相關。相比之下，AND門控強制雙抗原重合以改善選擇性，并可以納入不對稱親和力調節以最小化單抗原的主導結合。因此，多特異性TCEs作為OR或AND邏輯裝置的功能行為由靶點選擇、親和力調節和分子形式的綜合效應決定。

TME內TCE的條件活性化

為設計在TME中選擇性活化的TCEs，可以利用腫瘤相關蛋白酶、升高的細胞外ATP和酸性pH等特征來區分惡性與正常組織。其中，蛋白酶觸發的活化的已成為突出策略。例如，一種Probody EGFR×CD3 TCE包含一個肽“掩蔽物”，可阻斷抗原結合區域，并被腫瘤相關蛋白酶選擇性地切割以恢復靶點結合。臨床前研究中，該設計在體外對EGFR陽性腫瘤細胞實現了超過15,000倍的選擇性，相對于未掩蔽的對照品，并在結腸癌異種移植模型中誘導了劑量依賴性腫瘤消退。在非人靈長類動物中，安全性也顯著改善，其MTD比未掩蔽的對照品高出約60倍。類似地，一種Probody HER2×CD3 TCE在腫瘤中表現出蛋白酶依賴性活性，同時在正常組織中保持無活性，在NHPs中的MTD比未掩蔽版本高出約400倍。總體而言，Probody技術旨在通過最大化瘤內活性同時最小化OTOT毒性來拓寬治療窗，目前正在實體瘤和特定淋巴瘤中進行臨床評估。

除蛋白酶外，TME相關的代謝線索提供了條件活化的的替代觸發因素。正常組織與TME之間細胞外ATP水平的差異已被利用來設計條件活性生物制劑，包括改善抗CD137抗體安全性的策略。同時，腫瘤細胞中持續的有氧糖酵解驅動乳酸積累和TME酸化，為pH依賴性活化的方法提供了基礎。總體而言，TME響應性活化的策略有望擴大可靶向的腫瘤抗原范圍，特別是在實體瘤中。

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三、超越分子設計的TCE活性-安全性平衡決定因素

給藥方案和給藥途徑

給藥頻率和給藥途徑是臨床療效的關鍵決定因素。blinatumomab、tebentafusp和mosunetuzumab等CD3結合雙特異性抗體的臨床經驗驗證了逐步遞增給藥的實用性。通過從低劑量開始，逐步遞增至目標劑量水平，該策略有助于更安全的免疫結合并減輕CRS。皮下給藥提供了一種補充方法來進一步優化治療指數。通過降低峰血漿濃度，SC給藥途徑可以減輕毒性而不影響總體藥物暴露，同時提升患者便利性。在食蟹猴中的臨床前研究支持這一特征：雖然DuoBody CD3×CD20 TCE通過靜脈和SC兩種途徑顯示出的相當療效，但SC途徑產生了顯著更低的峰抗體濃度和相應的更低血漿細胞因子水平。然而，SC途徑促進淋巴吸收并增加與APCs的相互作用，可能提高抗藥物抗體形成的風險。因此，雖然SC途徑具有減少細胞因子釋放的益處，但其誘導免疫原性的潛力需要仔細考慮。

半衰期優化的藥代動力學效應

TCEs的半衰期是其藥代動力學特征的主要決定因素。例如，含Fc的形式利用Fcγ受體介導的再循環來延長全身循環時間。為確保安全性，這些Fc結構域通常經過工程化沉默突變以消除效應功能，包括抗體依賴性細胞毒性和抗體依賴性細胞吞噬作用，從而防止非特異性免疫活化的。或者，與人血清白蛋白結合提供了一種延長半衰期的可行策略，而不損害對腫瘤抗原的特異性結合。然而，半衰期延長從時空角度引入了關鍵權衡。雖然延長的全身暴露是可取的，但伴隨的分子大小增加可能阻礙組織穿透并限制在實體瘤核心內的藥物積累。因此，優化半衰期需要在全身可用性和瘤內分布之間仔細平衡。

此外，半衰期還通過靶點介導的藥物處置受到靶點生物學和結合親和力的約束。在正常組織中豐富表達的抗原可以作為“抗原池”，通過非腫瘤結合加速清除。例如，靶向EGFR的TCEs因EGFR在正常組織中廣泛表達而常常表現出縮短的半衰期。高結合親和力可能進一步加劇這種內化和降解。為減輕此類非特異性清除，可以采用親和力調節或加入掩蔽肽等策略以最小化非預期相互作用。

遞送方式和聯合療法

創新的遞送方法，包括溶瘤病毒和CAR-T細胞，實現了局部TCE產生，從而增加瘤內暴露和抗腫瘤活性。OVs提供了雙重作用機制：它們誘導局部炎癥以招募T細胞到腫瘤，并充當TCE生產的原位工廠。這種局部表達增強了瘤內藥物濃度，同時減少了全身暴露，從而擴大了治療窗。雖然病毒復制可以通過旁觀者效應增強抗原異質性細胞的殺傷，但OVs的復制能力和免疫原性必須仔細平衡以維持安全性。

類似地，CAR-T細胞可以被工程化為“活載體”，以腫瘤依賴的方式遞送TCEs。在抗原識別后，這些細胞可以被編程為分泌TCEs，從而介導雙重作用機制：CAR-T細胞的直接腫瘤細胞溶解和分泌的TCEs對內源性T細胞的招募。當前的努力聚焦于精細調節TCE分泌的幅度、時間和定位，以減輕CRS和過度免疫活化的。盡管載體介導的TCE遞送策略前景廣闊，但其臨床轉化取決于克服與載體安全性、遞送效率和在TME中性能相關的挑戰。

參考文獻：

Designing T-cell Engagers: Trade-offs Between Activity and Safety. Protein Cell. 2026 Jun 4:pwag038.