Adv Sci | 精準(zhǔn)干預(yù)帕金森癥受累直接通路的AAV載體工具箱

在調(diào)節(jié)機(jī)體運(yùn)動(dòng)行為的基底節(jié)神經(jīng)環(huán)路中，紋狀體中型多棘神經(jīng)元（MSN）扮演著關(guān)鍵的輸出角色，其主要由介導(dǎo)直接通路的D1-MSN和介導(dǎo)間接通路的D2-MSN兩類細(xì)胞群組成。帕金森病（PD）的核心病理在于黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性丟失，這直接導(dǎo)致D1-MSN因失去多巴胺遞質(zhì)的興奮性調(diào)節(jié)而陷入長(zhǎng)期抑制，破壞了直接通路和間接通路的平衡，臨床上表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)遲緩、肢體僵直等。因而，通過外源手段特異性地恢復(fù)D1-MSN的放電活性，被視為極具前景的潛在治療策略。

然而，現(xiàn)階段主流的神經(jīng)環(huán)路靶向調(diào)控技術(shù)高度依賴Cre/LoxP等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系，這使得相關(guān)成果極難直接應(yīng)用在非人類靈長(zhǎng)類等高等哺乳動(dòng)物或臨床患者身上。同時(shí)，現(xiàn)有的逆行腺相關(guān)病毒（AAV）在沿軸突末梢逆向標(biāo)記紋狀體時(shí)，常標(biāo)記大腦皮層等非目標(biāo)區(qū)域，產(chǎn)生明顯的脫靶效應(yīng)。因此，領(lǐng)域內(nèi)急需一種不依賴轉(zhuǎn)基因、兼具高逆行轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與跨物種普適性的D1-MSN特異性調(diào)控工具。

針對(duì)上述瓶頸，中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院劉太安副研究員聯(lián)合北京大學(xué)第一醫(yī)院姜玉武教授、南方醫(yī)科大學(xué)深圳市婦幼保健院李元濤教授和浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院陳曄菲研究員團(tuán)隊(duì)研發(fā)出了一套能夠精準(zhǔn)靶向紋狀體直接通路D1-MSN的新型逆向AAV載體系統(tǒng)，并展示了其在PD小鼠模型中的治療潛力。該成果近日發(fā)表于Advanced Science期刊，題為：A Toolkit for Targeted Neuromodulation of Striatal Direct Pathway Neurons Rescues Parkinsonian Motor Deficits in Mice。

研究團(tuán)隊(duì)首先在親本AAV9衣殼的特定表面外露位點(diǎn)（VR-VIII）引入隨機(jī)7肽，建立了包含近百萬(wàn)種獨(dú)特序列的突變體庫(kù)。在篩選機(jī)制上研究團(tuán)隊(duì)采用靶組織RNA轉(zhuǎn)錄本測(cè)序技術(shù)，確保篩選出的突變體均具備真實(shí)的轉(zhuǎn)錄活性。經(jīng)過多輪生物信息學(xué)迭代，最終鎖定了新型衣殼變體AAV9R4。定量檢測(cè)表明，AAV9R4向紋狀體逆向轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞數(shù)量比傳統(tǒng)AAV9高出8倍以上，且?guī)缀跬昝榔帘瘟藢?duì)皮層神經(jīng)元的非特異性標(biāo)記。

為賦予該系統(tǒng)更強(qiáng)的靶向性，團(tuán)隊(duì)檢索了人類大腦開放染色質(zhì)圖譜，在紋狀體高表達(dá)標(biāo)記物RGS9的基因座內(nèi)部，挖掘到了一個(gè)具備極強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活特征的順式調(diào)控元件R9E1。將R9E1與微型啟動(dòng)子聯(lián)動(dòng)并由AAV9R4載體搭載后，該系統(tǒng)在小鼠體內(nèi)展現(xiàn)出了優(yōu)異的細(xì)胞選擇性：在所有被逆行轉(zhuǎn)導(dǎo)的紋狀體神經(jīng)元中，多巴胺D1受體陽(yáng)性細(xì)胞占比突破了95%，而D2受體陽(yáng)性細(xì)胞則被成功排除，實(shí)現(xiàn)了物理空間與細(xì)胞身份的雙重鎖定。

為打通走向臨床的橋梁，研究人員將AAV9R4-R9E1調(diào)控病毒注射至成年食蟹獼猴的黑質(zhì)網(wǎng)狀部。數(shù)周后的大腦切片分析顯示，目標(biāo)基因表達(dá)信號(hào)高度集中在獼猴的尾狀核與殼核中，其不僅在大體積的靈長(zhǎng)類大腦中達(dá)到了10%~15%的D1-MSN整體轉(zhuǎn)導(dǎo)率，更完美復(fù)刻了對(duì)D1-MSN的選擇性標(biāo)記，證實(shí)該工具具備極佳的跨物種靶向保守性。

最后，團(tuán)隊(duì)將化學(xué)遺傳學(xué)調(diào)控元件經(jīng)AAV9R4-R9E1表達(dá)于因雙側(cè)注射6-OHDA而導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元受損的PD小鼠模型中。當(dāng)給予配體藥物CNO特異性激活D1-MSN直接通路后，PD小鼠的自主探索行為、運(yùn)動(dòng)速率以及肢體協(xié)調(diào)平衡能力均呈現(xiàn)出根本性的扭轉(zhuǎn)，運(yùn)動(dòng)遲緩癥狀基本消失。值得注意的是，不同于經(jīng)典的左旋多巴（L-DOPA）藥物療法往往引發(fā)異動(dòng)癥等副作用，該回路靶向精準(zhǔn)治療在長(zhǎng)期給藥期間未誘發(fā)明顯的異常不自主運(yùn)動(dòng)，安全性優(yōu)勢(shì)顯著。

綜上所述，該研究通過AAV衣殼的定向進(jìn)化與人源增強(qiáng)子挖掘策略，成功打造了“AAV9R4衣殼 + R9E1增強(qiáng)子”的模塊化靶向工具，在小鼠和獼猴模型中均實(shí)現(xiàn)了不依賴轉(zhuǎn)基因動(dòng)物對(duì)直接通路D1-MSN的精準(zhǔn)靶向控制。該系統(tǒng)不僅在小鼠上實(shí)現(xiàn)了帕金森癥狀的成功挽救，且避開了傳統(tǒng)多巴胺替代療法的異動(dòng)癥風(fēng)險(xiǎn)。雖然未來(lái)用于人類臨床時(shí)，還需克服人類大范圍定位注射等技術(shù)細(xì)節(jié)，但該成果為基底核病變及相關(guān)神經(jīng)精神疾患的精準(zhǔn)回路治療開辟了新的基因藥物開發(fā)路徑。

原文鏈接：https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202519665

制版人：十一

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