震驚！不是造假，但照樣撤稿：約 40% 的圖像問題出在?WB?上

在被撤稿的論文里，出現圖像問題最多的實驗類型是 Western Blot。 在期刊日趨嚴格的新規里，被明確要求提交原始數據的，同樣是 Western Blot。 當一張膜足以決定一篇論文的命運，你真的厘清了「數據完整性」這道關嗎？（點此直達試用福利）

一、WB，正站在「數據完整性」的聚光燈下

過去幾年，科研圈對「數據完整性（data integrity）」的審視力度空前提升，而 Western Blot（WB）恰好站在風暴中心。

兩項來自不同權威機構、卻指向同一結論的研究，值得每一位 WB 使用者高度警惕：

美國癌癥研究協會（AACR）在一項針對 1,367 篇文章的研究中發現：圖像問題最常見的來源正是 Western Blot，占比高達 40.8%[1]。一旦圖像完整性遭到舉報并經調查核實，結果往往就是撤稿。

PLOS ONE 對其出版倫理團隊在 2017～2019 年間處理的所有圖像完整性問題進行統計后發現：Western Blot 圖像問題位居首位[2]。正是基于這一發現，PLOS ONE 與 PLOS Biology 自 2019 年起要求作者提交原始、未裁剪的 blot 與 gel 圖像數據。

兩家機構，同一結論：在所有「出問題」的科研圖像中，WB 始終是出現頻率最高的類型。

換句話說，WB 已不再是「做出來好看就行」的實驗。它的每一條帶、每一次歸一化、每一步統計處理，都可能在投稿、返修乃至見刊后被反復檢驗。數據完整性，正從「加分項」變成「生死線」。

那么問題來了：為什么偏偏是 WB，成了圖像與數據完整性問題的重災區？

二、同一批數據，為什么能得出相反的結論？

近期發表于 Scientific Reports 的一項研究[3]（2024，DOI: 10.1038/s41598-024-70096-0）系統揭示了一個令人不安的事實：

WB 數據高度依賴實驗設計與統計處理方式，不同的處理方式可能導致截然相反的生物學結論。

研究團隊基于 6,000+ 張 WB、281 例動物樣本的數據庫，以脊髓損傷大鼠模型（N = 29，檢測 AMPA 受體亞基 GluA2）為例，對完全相同的一批原始數據用 8 種常見方式分別進行處理。結果令人警醒：效應量、統計功效、p 值在不同處理下大幅波動——某些方案「看不到效應」，換一種方案「效應顯著」。

數據沒變，結論卻已迥異。這種「處理方式不同、結果隨之而變」的脆弱性，正是 WB 容易出現數據完整性爭議的深層土壤——它給了變異和偏差太多藏身之處。

三、真正的元兇，不是「造假」，而是看不見的變異

需要指出的是：絕大多數 WB 數據問題，并非源于學術不端，而是研究者沒有意識到、也沒有控制住的技術變異。文章總結了四大核心來源：

1

抗體信號的非線性：

大多數 WB 分析默認「條帶密度與蛋白量成正比」。但在上樣量過低或過高的情況下，信號會偏離線性區。一旦超出線性范圍，定量結果本身就是錯的——后續再精密的統計也無法彌補。

圖 1. 確定抗體的線性范圍以優化 Western blot 數據的參數統計分析

當加載的蛋白濃度過低或過高時，Western blot 條帶強度（band density）與蛋白含量之間的關系往往會變為非線性。如果觀測到的信號與實際蛋白濃度之間出現偏離，那么分析結果可能會不準確。

2

不均衡的實驗設計：

PAGE 膠并非完全均勻。如果同一實驗組的樣本被集中加在相鄰泳道，膠的技術性差異就會與組間差異混淆。極端情況下，你根本無法區分「看到的差異」是生物學效應，還是膠本身的問題。

圖 2. 通過平衡設計（Counterbalancing）減少偏差

（A）實驗設計

一個用于說明平衡設計的簡化假設實驗。

? 兩個實驗組：野生型（Wild Type）vs 轉基因（Transgenic）

? 兩種處理：藥物（Drug）vs 對照（Vehicle）

該設計為一個 2（實驗條件）× 2（組織區域） 的因子設計，共形成 4 個實驗組。

平衡上樣（Gel Loading）

合理的平衡設計目標是：優化樣本上樣順序，使不同組別在整個凝膠中均勻分布

? 標注紅色 X 的情況：實驗組或處理條件集中分布于凝膠的某一區域 → 凝膠位置差異（gel variability）可能被誤認為是組間差異

? 標注綠色 ? 的情況：

實驗組和處理條件被均勻分散安排 → 有效降低某一組在局部區域過度集中的風險

3

技術重復的混亂處理：

把 3 個技術重復當作 3 個獨立樣本（偽重復），會把樣本量人為放大 3 倍—統計功效虛高，假陽性率飆升；而簡單取均值又會掩蓋重復間的真實波動。

4

上樣、泳道與膜之間的變異：

即大家最熟悉、卻也最容易出錯的環節：內參與歸一化（normalization）。

每一個未被控制的變異，都是數據完整性鏈條上的一道裂縫。

四、最隱蔽的「陷阱」：你習以為常的歸一化方式

研究特別強調：歸一化方式的選擇，直接決定數據的統計完整性。

最常見的做法是用目標蛋白除以內參（β-actin），得到一個比值。看似合理，實則埋著兩個雷：

比值是「乘法關系」而非線性關系，會人為扭曲方差，違背 t 檢驗、ANOVA 等常用方法的前提假設；

單一管家蛋白本身并不可靠—actin、GAPDH、tubulin 等高豐度蛋白常常處于飽和、脫離線性區，且其表達可能隨處理、疾病狀態而改變。

換句話說，當你的「標尺」本身在變，所有測量都失去了意義。而一個站不住腳的歸一化基準，正是圖像與數據完整性審查中最容易被質疑的環節之一。

研究給出的統計層面解法是：把內參作為協變量（covariate）納入線性混合模型（LMM），并把技術重復作為隨機效應處理。這樣既能扣除泳道間的技術變異，又不違反統計假設。當二者結合時，效應量更強、功效更高、p 值更低——在不增加樣本量的前提下，真實生物學效得以更清晰地呈現。

但這里有一個前提常被忽略：統計方法能挽救的，只是「測對了」的數據。如果上樣和內參環節本身就引入了偏差、又缺乏可追溯的原始記錄，再好的模型也只是在「錯誤的數據上做精致的計算」。

正是在這一點上，研究也明確指出：總蛋白染色（如熒光染色）可以作為比單一管家蛋白更優的上樣對照。

圖 3. Western blot 總蛋白內參示意圖

該圖展示了一個典型的多重檢測（multiplexed）Western blot 凝膠，主要包括：經抗體標記的目標蛋白條帶（綠色/黃色），以及作為上樣對照的內參蛋白（housekeeping protein）——目標蛋白在同一樣本、同一 lane 中同時檢測和定量。

五、從源頭守住數據完整性：Bio-Rad Stain-Free 與總蛋白歸一化（TPN）

要真正應對 WB 數據完整性問題，不能只靠「事后統計補救」，更要在數據采集階段就將變異納入控制、將原始記錄留存歸檔。這正是 Bio-Rad Stain-Free（免染）技術與總蛋白歸一化（Total Protein Normalization，TPN）的價值所在。

Stain-Free 技術：讓「看不見的變異」變得可見、可記錄

Bio-Rad 在 TGX Stain-Free 凝膠中預置了獨有的三鹵化合物。經短暫 UV 激活后，其與蛋白中的色氨酸殘基發生共價反應并發出熒光—無需染色、無需脫色，即可在凝膠和轉印膜上直接成像整條泳道的總蛋白。

這意味著你可以：

在上樣后幾分鐘內核驗各泳道的實際上樣量是否均衡；

可視化驗證轉印效率，排除「轉印不全」這一隱性誤差源；

全程避免傳統染色/脫色帶來的批次間波動與人為操作誤差；

留存完整泳道的總蛋白原始圖像——這恰恰契合了 PLOS 等期刊對「原始、未裁剪圖像數據」的要求，讓歸一化基準透明、可追溯、經得起審查。

TPN：用「總蛋白」取代「單一內參」

相比依賴單個管家蛋白，TPN 以每條泳道的全部蛋白信號作為歸一化基準。它的優勢恰好對應了研究中點名的痛點：

線性動態范圍更寬，不易像高豐度管家蛋白那樣飽和、脫離線性區；

不受單一蛋白表達變化的干擾，處理組與對照組之間更具可比性；

更真實地反映泳道間的實際上樣差異，從源頭降低技術變異；

歸一化邏輯清晰可復現，在面對圖像完整性審查時更具說服力。

可以說，Stain-Free + TPN 把研究中「總蛋白染色優于單一管家蛋白」的科學建議，變成了一套快速、定量、可重復、可追溯的標準化流程 — 在原始數據生成的那一刻，就為數據完整性把好了第一道關。

六、數據完整性，是從設計到分析的全鏈條工程

當 AACR 與 PLOS 的統計不約而同地把 WB 列為圖像問題的頭號來源、當頂刊開始要求提交原始 blot 圖像，WB 數據完整性已不再是「做完實驗再考慮」的事后問題。它的真正風險，從來不是某一步的疏忽，而是貫穿「線性范圍—實驗設計—技術重復—歸一化—統計分析」全鏈條的累積變異，以及原始記錄的缺失。

應對的路線圖其實很清晰：

采集端：確定抗體線性范圍、合理交叉平衡上樣、用總蛋白作可靠且可記錄的上樣對照；

分析端：內參當協變量、把重復當隨機效應，用更嚴謹的模型識別真實效應。

Bio-Rad 的成像儀在數據完整性上的措施與優勢不僅包括 Stain-Free 與總蛋白內參技術，還包括：

1

.scn 原始數據格式 — 這是一種不可修改的專有二進制格式，內含完整的實驗元數據，相比其他系統可隨意編輯的通用 TIF 格式，從根本上杜絕了圖像與元數據被篡改的風險，完美契合頂級期刊對原始數據可溯源、可存檔的要求。

2

軟件層面的權限分級與數據安全管理 — 支持密碼保護、新賬號管理員審核,可禁止數據刪除(防止惡意或誤操作)、禁止數據聯網導出、限制 U 盤拷貝并對導出做安全驗證，從而保障原始數據長期、安全、可追溯地保存。

3

高性能光學配置 — 通過專有低噪音高量子產率 CCD、濾光片后置光路、暗箱內壁與透鏡組特殊涂層等設計，最大程度降低雜散光與熒光背景、提升信噪比，確保成像具備清晰的灰色背景與銳利的膜邊緣、避免過高對比度，滿足 Nature、Science 等期刊對 WB 圖像背景呈現的明確規定。

現在還有免費試用活動，

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與其在投稿、返修甚至撤稿調查時為數據反復辯解，不如從第一張膠開始，就讓你的 WB 經得起檢驗。

注：

1. 相關產品僅限科研使用，不作為臨床診斷。

2. Bio-Rad 為 Bio-Rad Laboratories, Inc. 在特定區域的商標。本文所使用的所有商標均歸其各自所有者所有。? 2026 Bio-Rad Laboratories, Inc.

3. 本活動的最終解釋權歸伯樂生命醫學產品（上海）有限公司。

內容策劃：沈佳鈺

內容審核：周育紅

題圖來源：Bio-Rad

參考文獻：

[1]. https://www.labonline.com.au/content/computing-hardware-software/article/image-integrity-best-practice-the-problem-with-altering-western-blots-1593705893

[2]. Redefining standards in image data reporting: A new policy at PLOS ONE and PLOS Biology requires raw blot and gel image data - The Official PLOS Blog

[3]. Omondi C., et al. Improving rigor and reproducibility in western blot experiments with the blotRig analysis. Scientific Reports. 2024;14:21644.