Adv?Sci?|?佘群新/馮旭團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)多同源臂CRISPR基因組修剪策略CREAT，實(shí)現(xiàn)微生物基因組高效精簡(jiǎn)

構(gòu)建最小基因組微生物，既是探索生命核心代謝途徑、解答“維持生命所需最小基因集合”基礎(chǔ)命題的理想模型，也是合成生物學(xué)中打造高效工業(yè)生物制造底盤(pán)的關(guān)鍵路徑。目前主流的“自上而下”基因組縮減策略，受限于必需基因注釋不全、合成致死效應(yīng)與功能冗余基因廣泛存在等問(wèn)題，大片段基因組刪除往往反復(fù)失敗，只能通過(guò)逐段試錯(cuò)、多輪迭代的方式緩慢推進(jìn)，效率與深度均面臨長(zhǎng)期瓶頸。

近日，山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室CRISPR與古菌生物學(xué)研究中心佘群新教授、馮旭研究員團(tuán)隊(duì)在Advanced Science在線發(fā)表題為CREAT: A CRISPR-Based Genome Trimming Strategy for Systematic Identification of Dispensable Regions and Rapid Genome Reduction的研究論文。團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新性提出名為CREAT的多同源臂模板CRISPR基因組修剪策略，將CRISPR靶向基因組切割與“同源臂步移”技術(shù)創(chuàng)新融合，建立“必需區(qū)分類-合成式替換”的兩步式工作流，在古菌模式生物中實(shí)現(xiàn)20.8%的基因組縮減，并成功拓展至多種細(xì)菌，為系統(tǒng)性、高效構(gòu)建微生物最小基因組提供了通用新工具。

為解決傳統(tǒng)刪除方法“試錯(cuò)成本高、分區(qū)效率低”的核心痛點(diǎn)，研究團(tuán)隊(duì)受真核生物VDJ重組產(chǎn)生抗體多樣性的機(jī)制啟發(fā)，開(kāi)發(fā)了同源臂步移（Homology arms walking, HA walking）技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)設(shè)計(jì)串聯(lián)排列的多同源臂作為修復(fù)模板，在CRISPR靶向切割產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂后，靶向位點(diǎn)兩側(cè)的不同組合的同源臂與基因組發(fā)生隨機(jī)同源重組，可在單次實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生覆蓋所有缺失組合的突變體庫(kù)，從而系統(tǒng)劃分目標(biāo)區(qū)段內(nèi)的非必需區(qū)、必需區(qū)與準(zhǔn)必需區(qū)。這一方法將多輪功能驗(yàn)證整合為一步化的多重分析，不僅大幅提升了分區(qū)效率，還能同步篩選出生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)更優(yōu)的突變株，為獲得性能優(yōu)良的精簡(jiǎn)基因組菌株提供了天然便利。

隨后基于同源臂步移獲得的精確必需基因信息，研究團(tuán)隊(duì)建立了完整的CREAT基因組精簡(jiǎn)核心流程：將鑒定得到的必需/準(zhǔn)必需基因組裝為人工合成的同源臂模塊，通過(guò)一步基因組替換，將原本分散在必需區(qū)之間的非連續(xù)非必需序列一次性精準(zhǔn)刪除，直接獲得深度修剪的基因組突變株。系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明，CREAT策略同時(shí)適用于古菌與細(xì)菌，兼容內(nèi)源I型CRISPR、外源Cas9等多種編輯系統(tǒng)，具備良好的普適性與多輪迭代能力。

圖1. CREAT基因組精簡(jiǎn)策略示意圖

總體而言，CREAT策略突破了傳統(tǒng)基因組縮減“逐段試錯(cuò)、多輪迭代”的技術(shù)局限，將多輪功能驗(yàn)證整合為一步化的多重分析，顯著提升了最小基因組構(gòu)建的效率與系統(tǒng)性。該技術(shù)不僅為不同微生物底盤(pán)的最小基因組理性設(shè)計(jì)與快速構(gòu)建提供了通用方案，也為合成生物學(xué)底盤(pán)細(xì)胞的工程化改造提供了全新工具。

論文由山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室作為第一完成單位和通訊作者單位。博士后袁冠華為論文第一作者，馮旭研究員與佘群新教授為共同通訊作者。

原文鏈接：https://doi.org/10.1002/advs.76042

制版人：十一

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