江南大學周志/廈門大學王斌舉ACS Catal：人工酶催化不對稱曼尼希反應實現手性環狀磺酰胺的酶法合成

導讀

磺酰胺基團是許多藥物中的關鍵藥效團，其中七元環狀磺酰胺化合物因其結構和生物學特性而備受重視。然而生物催化合成手性環狀磺酰胺化合物的研究仍較少。近日，江南大學周志教授組聯合廈門大學王斌舉教授組在知名期刊ACS Catalysis上發表了題為“Enantioselective Biocatalytic Mannich Reaction for the Synthesis of Cyclic Sulfonamides by an Artificial Enzyme”的研究論文。該研究報道了一種含非天然仲胺催化中心的人工酶，通過烯胺催化機制活化環己酮類化合物，實現了環狀酮與環狀亞胺之間的不對稱曼尼希反應。經過多輪迭代工程優化，最優變體能夠以高立體選擇性和高反應活性合成手性七元環狀磺酰胺產物。利用動力學模擬和QM/MM計算揭示了關鍵的活性位點相互作用和過渡態特征。這項工作建立了一種手性環狀磺酰胺的生物催化制備方法，并突顯了共價錨定策略人工酶在實現非天然反應的巨大潛力，這些轉化在藥物化學領域具有潛在的應用價值。

磺酰胺基團是一種具有特殊藥理活性的結構單元，廣泛存在于臨床藥物中。經典的磺胺類抗生素，如磺胺甲噁唑，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均表現出廣譜抗菌活性。七元環磺胺基團在生物活性分子中較為常見，因其獨特的結構和構象特征在藥物化學中構成了重要的藥效團單元。曼尼希反應是有機化學中一種經典的C–C鍵形成反應，廣泛用于合成手性β-氨基化合物。盡管曼尼希反應在有機催化領域已得到了廣泛的發展，但關于酶催化曼尼希反應的研究卻相對較少。研究人員報道了一例天然曼尼希酶LolT的發現，這是一種吡哆醛-5'-磷酸（PLP）依賴性酶，可催化立體選擇性的分子內和分子間曼尼希反應。總體而言，關于天然或人工酶催化的曼尼希反應的研究仍較為匱乏。因此，開發更多類型的曼尼希酶對于實現多樣性手性β-氨基羰基類化合物的高效生物合成有著重要的意義。

圖1 人工酶催化實現磺酰胺類化合物的不對稱合成

基于課題組之前成功構建的人工酶體系。本研究中使用的蛋白骨架為乳酸乳球菌多藥耐藥性調節劑（LmrR），非天然吡咯烷催化中心可以在溫和的條件下，通過吡咯烷二硫化物共價修飾半胱氨酸殘基而高效引入可成功構建含非天然仲胺催化中心的人工酶。對于曼尼希反應的設計，環己酮1a與七元環狀亞胺2a被選擇為模板底物，基于前期研究基礎，作者從LmrR_Cys_SA的酶庫中篩選到LmrR_M89C_L57A_SA (LmrR_89SA_1.0) 展示出相較于各空白組對照較好的立體選擇性與產率（99%產率，68.5:31.5 e.r.，12:1 d.r.），產物絕對構型最終確定為(2S, 1’R)。

圖2 人工酶催化反應篩選

后續作者驗證使用細胞裂解液代替純化酶的情況下，人工酶構建依然可行且催化反應仍具備立體選擇性。后續基于粗酶篩選體系，并結合MD模擬結果，經4輪定向進化獲得的最優變體LmrR_89SA_5.0在優化條件下可實現>99%產率，95.5:4.5 e.r.，>20:1 d.r.以合成目標產物3a（圖3）。動力學結果表明，LmrR_89SA_5.0的催化效率（kcat/KM）為LmrR_89SA_1.0的3.5倍。

圖3 人工酶定向進化

作者基于進化變體LmrR_89SA_5.0進行底物譜考察（圖4）。該變體對各類取代芳基的環狀亞胺底物均顯示出良好的耐受性，并對大部分底物具備優秀的手性控制（86-91% e.e.，＞20:1 d.r.）。進化變體顯示出對六元環狀酮明顯偏好，但對五元、七元環狀酮立體選擇性控制較差，分子動力學模擬結果顯示，只有環己酮能穩定地結合在活性位點中（其C1–C2距離在~5–7 ?左右波動），而環戊酮和環庚酮的C1–C2距離均較大（>8 ?，甚至高達~15 ?），這表明它們從活性中心脫離。

圖4 人工酶催化反應底物譜考察

為了闡明人工曼尼希酶 LmrR_89SA_5.0 所表現出的高立體選擇性的起源，作者結合了分子動力學（MD）模擬和量子力學/分子力學（QM/MM）計算。分子對接及隨后的分子動力學模擬考慮了底物可能的四種結合構象，它們分別對應于 R-R、S-R、S-S 和 R-S 產物立體異構體。對C1-C2距離波動的分析（圖 5）表明，只有與S-R產物相關的結合構象在酶的活性口袋內保持穩定。關鍵氨基酸殘基的作用也可能通過穩定中間體的構象來影響反應的立體選擇性。為了驗證其作用，將丙氨酸突變引入了Asn14、Arg10和Arg56殘基中——這些殘基在分子動力學模擬結果中位于底物4 ?范圍內，并與反應中間體形成氫鍵。結果表明 N14 起著關鍵作用，這體現在 N14A 突變體的立體選擇性從91% 下降至35%。為了全面評估形成其他可能的異構體的可行性，作者還對R-R產物構象進行了QM/MM計算。選取了從相應的分子動力學軌跡中提取的、C1-C2距離為5.78 ?的代表性結構作為起點。隨后的勢能面掃描顯示，R-R路徑存在一個顯著較高的能量障礙，為38.9 kcal/mol。該能壘遠高于S-R產物路徑的計算值，表明R-R路徑在動力學上極不受青睞。這一結果與實驗觀察到的立體選擇性非常吻合，為該酶對S-R 產物的特異性催化提供了有力的計算證據。

圖5 酶催化反應機制解析

總結

本文報道了一例人工酶催化環狀酮與環狀磺酰亞胺之間的不對稱曼尼希反應，高效合成了具有兩個手性中心和軸手性中心的對映體富集的七元環狀磺酰胺。通過迭代定向進化，獲得了能夠以極佳收率（高達>99%）、高對映體選擇性（高達95.5:4.5 e.r.）和異構體選擇性（>20:1 d.r.）生成目標產物的變體。結合分子動力學（MD）模擬和QM/MM計算，闡明了導致所觀察到的立體控制的關鍵活性位點相互作用和過渡態特征。這項工作拓展了基于胺催化中心人工酶的反應類型與應用范圍，并為結構獨特的手性環狀磺酰胺類化合物的高效生物合成提供了新的策略。

這一成果近期發表在ACS Catalysis上，江南大學周志教授和廈門大學王斌舉教授為論文共同通訊作者，江南大學博士生朱致熹、碩士生胡沁汝和廈門大學博士后吳瑤為論文共同第一作者。工作得到了科技部重點研發計劃、國家自然科學基金等項目的支持。

文章鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.6c03969

周志教授課題組主頁：https://www.x-mol.com/groups/zhouzhi