JBC |?華進聯/李娜團隊：銀杏內酯A靶向細胞色素c抑制內源性凋亡，促進多能干細胞向心肌細胞分化

心肌梗死之所以難以有效治療，根本原因在于成年心肌細胞的再生能力極為有限。利用人多能干細胞定向誘導分化為心肌細胞，是目前補充受損心肌最具前景的策略之一。然而，這一方向在臨床轉化與規模化制備中長期面臨兩大難題：分化效率不穩定，以及分化過程中大量細胞發生凋亡，終末細胞產量大打折扣。尤其在干細胞開始向心臟譜系特化的關鍵過渡階段，程序性細胞死亡極易被觸發，進一步制約了有效細胞的獲得。

銀杏葉中提取的二萜內酯類化合物銀杏內酯A（Ginkgolide A, GA）此前已被報道具有心臟保護活性，并可通過激活PI3K/Akt通路、緩解內質網應激等機制抑制神經元和內皮細胞的凋亡。但GA是否直接影響多能干細胞向心肌細胞的分化進程，以及其背后的具體分子機制，一直未被闡明。

近日，西北農林科技大學動物醫學院華進聯課題組在Journal of Biological Chemistry上發表了題為Ginkgolide A Enhances Cardiomyocyte Differentiation from Pluripotent Stem Cells by Targeting Cytochrome c to Attenuate Intrinsic Apoptosis的研究論文。研究團隊綜合運用表型篩選、轉錄組學與計算生物學手段，揭示了GA直接靶向細胞色素c（CYC）并抑制內源性線粒體凋亡通路，從而顯著提升多能干細胞向心肌細胞分化效率的新機制。

為高效篩選影響心肌分化的活性化合物，研究者首先利用CRISPR-Cas9基因編輯技術，在人多能干細胞的TNNT2基因終止密碼子前框內敲入H2B-mCherry-PuroR序列，構建了TNNT2-mCherry報告細胞系。TNNT2編碼心肌肌鈣蛋白T，是心肌細胞分化成熟的關鍵標志物，其表達上調可直接反映分化進程。流式細胞術分析表明，該報告細胞系在分化第10天的心肌誘導效率可達80%以上，與未編輯的胚胎干細胞相當。免疫熒光染色顯示，因H2B標簽而呈現核定位的mCherry紅色熒光與TNNT2、NKX2-5及ISL1等心肌特異性標志蛋白完全共定位。這一報告系統的成功構建，為后續銀杏內酯類化合物的篩選提供了可靠的實時監測平臺。

在此基礎上，研究團隊選取銀杏內酯家族中三個代表性成員——GA（含一個羥基）、GB（含兩個羥基）和GK（含兩個羥基及額外的碳碳雙鍵）——在分化全程分別以50 μM和100 μM濃度進行處理。結果表明，GA和GB均可顯著提高心肌誘導效率，而GK未呈現明顯效果。值得注意的是，在100 μM和150 μM濃度下，GA處理組的細胞團出現自發搏動的時間提前至第5天。免疫熒光與流式細胞術定量分析一致證實，GA可顯著上調心臟核心轉錄因子NKX2-5及心肌結構蛋白TNNT2的表達水平。

為探究GA促進心肌分化的內在機理，研究者將目光集中于細胞凋亡。利用Annexin V與活化Caspase-3雙染結合流式細胞術進行分析，在未處理對照組的分化第5天，凋亡細胞比例高達34.2%，而經100 μM和150 μM GA處理后，該比例分別降至16.8%和8.5%。Western blot檢測進一步顯示，切割型PARP、切割型Caspase-9和切割型Caspase-3的水平隨GA濃度升高呈劑量依賴性降低。引人注意的是，BCL2與BAX蛋白表達量并無顯著變化，這提示GA的抗凋亡效應并非經由傳統的BCL2/BAX通路所介導。與此同時，GA處理還上調了心臟中胚層標志物MESP1（第4天）以及心臟祖細胞標志物NKX2-5和ISL1（第5天）的表達。然而，當GA濃度增至200 μM時，心臟中胚層標志物的表達反而受到抑制，這一現象暗示，適度的凋亡對于正常的譜系定型具有生理必要性，完全消除凋亡反而可能干擾發育程序的正常進行。

為了全景式地揭示GA的作用機制，研究者在心臟中胚層（第4天）、心臟祖細胞（第5天）和早期心肌細胞（第6天）三個關鍵分化節點進行了轉錄組測序。主成分分析顯示，GA對未分化多能干細胞的轉錄組影響甚微，但在心臟祖細胞和早期心肌細胞階段，基因表達譜卻發生了顯著重塑，表明GA的調控作用具有嚴格的發育階段依賴性。GO富集分析鑒定出多個與凋亡過程相關的基因簇，抗凋亡基因如MCL1、XIAP、BIRC5、BCL2和BCL2L1等在GA處理后均發生上調；同時，核心心肌轉錄因子NKX2-5、TBX5、GATA4和ISL1的表達亦顯著升高。GSEA分析進一步確認，凋亡相關通路在GA處理的心臟祖細胞和早期心肌細胞中均呈現顯著富集，且后者的富集程度更為突出。此外，KEGG與GO分析還發現，GA不僅影響凋亡與心肌分化相關通路，還波及“干細胞多能性調控信號通路”“ATP依賴的染色質重塑”“肌細胞骨架”等生物學過程，并延伸至RNA剪接和mRNA加工等表觀調控層面，提示GA很可能參與了心肌命運決定過程中的代謝重塑。

在蛋白質水平上，GA使Caspase-9、Caspase-3及PARP的切割均減少，但其直接作用靶點仍需明確。研究團隊利用PharmMapper與DrugCLIP進行反向藥效團匹配，并結合GO/KEGG富集分析，將靶點鎖定于細胞色素c——內源性線粒體凋亡通路的核心分子。細胞色素c自線粒體釋放后，與凋亡蛋白酶激活因子-1（APAF-1）結合，啟動凋亡小體組裝并激活Caspase-9級聯反應。分子對接預測顯示，GA與細胞色素c可以形成穩定結合，預測結合自由能為-5.4 kcal/mol。GA的C10位羰基氧分別與細胞色素c的Lys27側鏈（氫鍵距離3.5 ?）及Ser15（氫鍵距離2.2 ?）形成氫鍵，該結果亦經LigPlot?分析所確認。更為關鍵的是，研究團隊運用AlphaFold3預測了細胞色素c與APAF-1的復合物結構，疊加分析揭示，GA的結合位點與細胞色素c/APAF-1互作界面高度重疊。細胞色素c上參與APAF-1結合的關鍵殘基（如Lys25、Lys27、Gln16）恰好位于GA所占據的區域附近。APAF-1表面的酸性殘基簇與細胞色素c的堿性殘基簇之間原本依賴靜電互補和氫鍵網絡實現高親和力結合，GA的插入很可能通過空間位阻和氫鍵網絡擾動，削弱了細胞色素c對APAF-1的識別與結合，從而阻斷凋亡信號的向下傳導。鑒于細胞色素c與APAF-1自身的結合親和力極高（超低鹽條件下結合常數超過1011 M?1，對應結合自由能約-15.6 kcal/mol），GA發揮效應的主要窗口期應位于細胞色素c尚未與APAF-1結合之前，這與實驗中自分化起始即添加GA的處理策略完全吻合。

綜合以上發現，該研究提出了一種清晰的機制模型：GA直接靶向細胞色素c，干擾其與APAF-1的相互作用，從而抑制內源性線粒體凋亡通路，顯著減少分化過程中的細胞凋亡；同時，抗凋亡基因與核心心肌轉錄因子的協同上調共同構筑了一個促存活、促分化的微環境，最終大幅提高了多能干細胞向心肌細胞的分化效率。從應用角度看，GA作為銀杏葉來源的天然純化產物，相較于合成化合物在法規監管方面具備天然優勢。若將其作為細胞培養添加劑，應用于干細胞規模化擴增與定向分化過程中，有望有效降低細胞損失，提升終產品得率，為基于干細胞的再生醫學及生物制造提供一種安全、高效的新方案。該研究不僅為理解天然產物調控細胞命運提供了新視角，也為現代細胞技術與傳統中藥資源的交叉融合開辟了新的路徑。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.jbc.2026.113224

制版人：十一

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