江南大學周志/廈門大學王斌舉Nat Commun｜人工酶的細胞內高效組裝及體內非天然不對稱生物合成

導讀

通過將非催化輔因子引入蛋白質骨架而構建的人工酶，正逐漸成為針對非天然反應的極具前景的生物催化劑。然而，由于復雜的細胞環境帶來了諸多挑戰，開發細胞內人工酶的構建策略及非天然催化功能具有較大的挑戰，特別是在細胞內進行立體選擇性生物合成的人工酶研究報道十分有限。因此，如何在細胞內構建含有非天然催化中心的人工酶并在體內實現其非天然不對稱催化功能是當前面臨的關鍵科學問題。近日，江南大學周志教授組聯合廈門大學王斌舉教授組在知名期刊Nature Communications上發表了題為“Intracellular assembly of artificial enzymes for cytoplasmic enantioselective Mannich reactions”的研究論文。該研究報道了一種基于蛋白與非天然催化輔因子共價修飾的人工酶細胞內高效構建策略。僅需將表達目標蛋白的細胞與人工輔因子進行短時間孵育，可實現含非天然催化中心人工酶的快速高效組裝。體內成功組裝的人工酶可高效催化一例不對稱曼尼希反應，并在細胞內和體外高效合成非天然手性β-氨基酮。利用該策略，可通過全細胞催化循環系統實現了目標非天然手性含氮化合物的克級生產，從而展示了其在非天然生物合成中的應用潛力。這項工作建立了一種簡單且具有普適性的人工酶體內構建方法，可利用多種生物支架和合成輔因子，在細胞內構建具有新型功能的人工酶，從而擴展了在細胞內進行定制化合成應用的生物酶元件庫。

人工酶的設計與工程化代表了生物催化領域的一個變革性前沿，它融合了蛋白質設計、化學生物學、有機合成和定向進化的原理，以擴展自然界分子機器的催化能力。盡管在設計具有定制化體外反應性的人工酶方面已取得顯著進展，但將這些系統應用于活細胞內進行多樣化的非生物轉化仍是一項艱巨的挑戰，特別是對于需要嚴格立體控制的不對稱轉化而言。在細胞內構建人工酶面臨的一個核心挑戰，是如何將非生物催化輔因子高效且位點特異性地嵌入蛋白質的活性位點空腔中。在體外，通常采用共價鍵、供體和超分子策略，為蛋白質支架賦予非天然催化位點。然而，細胞內環境帶來了額外的復雜性，因為競爭性的親核試劑、氧化還原過程以及蛋白質穩態網絡可能會影響輔因子的穩定性、蛋白質的折疊以及催化性能。

早期研究主要側重于利用親和錨定技術在細胞內組裝人工金屬酶（ArMs），以最大限度地減少細胞內環境的影響。將非天然氨基酸納入酶設計，是構建細胞系統內人工酶的一種極具前景的策略。然而，工程化酶表達水平低、細胞內立體選擇性受限以及催化活性下降等挑戰很大程度上限制了該方法的應用范圍。在細胞內設計人工酶時，共價修飾方法少有探索，因為共價修飾方法通常需要在純化的酶。然而，在簡便性和通用性方面，共價策略具有明顯的優勢。將其應用于人工酶的高效細胞內組裝，可大幅拓寬可用于全細胞生物催化的酶類和催化反應的多樣性。本文報道了一種通過共價錨定實現人工酶的細胞內組裝的高效策略，與天然酶類似的方式，通過向攜帶多種蛋白質骨架的細胞中直接添加合成催化輔因子孵育，人工酶通過在細胞內與人工仲胺輔因子高效地形成共價二硫鍵構建而成，整個過程簡單高效。

圖1 人工酶的細胞內組裝及非天然催化反應

先前作者曾報道過通過二硫鍵交換，將催化性仲胺輔因子（SA）共價嵌入純化的 LmrR骨架口袋中，從而在體外構建了人工邁克爾酶 LmrR_SA。作者將攜帶 LmrR_Cys 蛋白的大腸桿菌與不同濃度的合成輔因子SA及不同反應時間進行孵育，研究合成輔因子 SA 與目標生物支架 LmrR 在細胞內的生物偶聯效率，并發現細胞與合成輔因子SA孵育僅10分鐘即可在細胞內高效構建完成目標人工酶。此后，作者設置環己酮與環狀亞胺的Mannich反應為模板反應并使用細胞內構建的人工酶進行活性測試，攜帶蛋白LmrR_L57C_N88A的大腸桿菌的參與全細胞反應的初始活性與立體選擇性最高（58% e.e.，9:1 d.r., 58% 產率），空白對照組證明目標蛋白與輔因子對高立體選擇性的反應缺一不可。在測試其他蛋白骨架（Myoglobin，Nitrobindin）與純酶活性驗證后，作者確定LmrR_L57C_N88A_SA1（AM_57SA_2.0）為最佳起始蛋白以獲得目標產物(R, S)-3a（73% e.e.，10:1 d.r., 98% 產率）。

圖2 人工酶的體內和體外構建及催化的不對稱反應

為進一步提高反應立體選擇性，作者基于粗酶的篩選策略進行了定向進化，并驗證合成的輔因子SA無需像傳統共價人工酶進行復雜的預處理，可類似于天然輔因子磷酸吡哆醛（PLP）和硫胺素焦磷酸（ThDP）等，直接向粗酶液中加入如即可在反應體系中有效發揮作用。在經過三輪定向進化后，獲得最優變體AM_57SA_5.0（96% e.e.，>20:1 d.r., >99% 產率），其催化效率約為(kcat/KM(imine))為AM_57SA_1.0的1.7倍，并且在全細胞反應條件下，反應保持了較好的立體選擇性（90% e.e.，>20:1 d.r., >99%產率）。

圖3 人工酶的定向進化

在確定了最優條件并獲得了進化突變體后，我們分別在細胞內和體外條件下，研究了進化突變體AM_57SA_5.0介導的曼尼希反應的底物范圍（圖4）。環狀亞胺的兩個芳香環上的取代包括甲氧基、鹵素、氰基和空間位阻較大的叔丁基等，無論在細胞內還是體外反應中均能被很好地容忍（3a-3s），但全細胞下的反應立體選擇性均略低于純酶反應結果。環狀酮的結構特征顯著影響反應的立體選擇性和反應性。與4-氧代硫環戊烷（3t）和4,4-二甲基環己酮（3v）的反應保持了優異的對映體選擇性和收率。

圖 4 人工酶體內和體外催化不對稱曼尼希反應底物譜考察

作者為驗證在全細胞系統內高效構建人工酶所采用策略的有效性和實用性，在全細胞條件下，通過人工酶對手性曼尼希產物進行了半制備和克級制備合成。首先，在OD600=10的條件下，利用攜帶AM_57SA_5.0的大腸桿菌細胞對6種手性磺酰胺進行了半制備級別生物合成（30 mg），且具有良好的立體選擇性。為了進一步說明設計的細胞內人工酶構建策略在非天然產物生物合成中的適用性，作者設計了一個全細胞催化循環系統，以實現非天然手性磺酰胺的克級生產，在800 mL體系中進行4次循環反應實現，最終，分離獲得了1.06 g手性磺酰胺(R, S)-3a，其對映體選擇性為90%，d.r.值>20:1，分離收率達97%。

圖5 人工酶催化在全細胞生物合成中的應用示范

作者進一步通過實驗證明該不對稱曼尼希反應是否在細胞內發生的。通過設計實驗，驗證僅含有目的蛋白的菌沉淀具備明顯的催化活性，反應中游離輔因子以及可能游離的蛋白對反應影響較小。這些實驗表明該不對稱曼尼希反應是由細胞內的人工酶而非細胞外的人工酶催化的。作者通過向全細胞體系中額外加入輔因子當量比的谷胱甘肽，觀察到反應立體選擇性與活性下降非常有限，證明全細胞體系中細胞內谷胱甘肽對催化性能的影響微乎其微，反應12小時后人工酶仍然保持完整二硫鍵結構，表明胞內組裝的人工酶具有良好的穩定性。

圖6 人工酶細胞內反應驗證實驗

為了理解這些人工曼尼希酶在調控立體選擇性方面的機制和關鍵因素，作者進行分子動力學（MD）模擬和QM/MM計算。由于兩個底物之間的C-C偶聯可能導致產物出現四種立體選擇性（R–R、S–R、S–S、R–S），因此在分子對接和分子動力學模擬過程中考慮了四種底物結合構象。在此體系中，僅有R–S相關結合構象的兩種底物能夠維持穩定且保持適宜的C1-C2距離（3 ?）。后續作者基于分子動力學模擬中確定的穩定結構，進行了QM/MM計算以評估C1–C2鍵形成的能壘。反應物復合物 (RC) 的 QM/MM 優化結構顯示C1-C2距離為2.96 ?。以RC為起點，QM/MM 計算表明C1-C2鍵的形成面臨 5.2 kcal/mol 的能量勢壘。值得注意的是，Arg10和Arg56通過形成氫鍵網絡中的鹽橋相互作用來穩定底物，這與突變實驗結果一致。將這兩個殘基均替換為丙氨酸會導致產物收率顯著降低。隨后進一步的分子動力學模擬表明，水分子會進入活性位點并促進水解反應。QM/MM 計算顯示，IM1 的水解涉及 20.4 kcal mol?1 的活化能壘（IM1’→TS3），這表明水解反應可能是整個轉化過程中的速率決定步驟。

圖7 酶催化曼尼希反應機制解析

總結

本文報道了一種簡單、高效的人工酶細胞內構建策略，只需將非天然輔因子與細胞進行短時間混合，即可在細胞內成功構建含非天然催化中心的目標人工酶元件。該細胞內人工酶在非天然不對稱曼尼希反應中表現出顯著的催化活性，展現出優異的對映體選擇性和廣泛的底物適用范圍。這種在細胞內構建人工酶的策略，在克級規模合成非天然手性分子方面展現出巨大的應用潛力。晶體學分析與計算研究共同為理解人工酶催化反應的立體選擇性和催化活性提供了結構基礎和機理見解。總體而言，這項工作提出了一種多功能且可推廣的方法，用于在細胞內構建具有新功能的人工酶，該策略可廣泛應用于擴展人工酶的細胞內催化能力，以實現多種非天然手性化合物的細胞內生產，從而為在活細胞中構建新型非天然生物合成途徑提供了一條有效的策略。

這一成果近期發表在Nature Communications上，江南大學周志教授和廈門大學王斌舉教授為論文共同通訊作者，江南大學博士生朱致熹、碩士生胡沁汝和廈門大學博士后吳瑤為論文共同第一作者。工作得到了科技部重點研發計劃、國家自然科學基金等項目的支持。

文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-026-75059-9?sessionid=-info

周志教授課題組主頁：https://www.x-mol.com/groups/zhouzhi