eLife｜黃術強團隊開發LUNA自動對焦系統，揭示細菌冷休克新機制

細菌冷休克反應是微生物應對環境溫度驟降的核心適應性機制，但其復雜的生理調控過程至今未被充分理解。長期以來，相關研究主要依賴群體水平測量，雖能揭示“生長停滯”等宏觀特征，卻難以通過在單細胞水平上開展高時空分辨的動態觀測來深入解析冷休克反應的調控機制。然而，誘導冷休克所需的快速大幅降溫會導致顯微鏡焦平面發生嚴重漂移，遠超現有自動對焦技術的補償能力，嚴重限制了對細菌低溫適應機制的研究。

近日，中國科學院深圳先進技術研究院定量合成生物學全國重點實驗室/合成生物學研究所黃術強研究員團隊，在eLife期刊發表了題為A coma pattern-based autofocusing method resolves bacterial cold shock response at single-cell level的重要研究成果。團隊創新性地開發了一套名為LUNA（Locking Under Nanoscale Accuracy）的自動對焦系統，利用檢測光的彗差圖案來精確鎖定焦平面，將顯微鏡的聚焦精度提升至3納米以內，并將有效工作范圍擴展至物鏡焦深的40倍以上。借助LUNA，研究團隊在單細胞水平下完整記錄了細菌從37°C到14°C冷休克后的全過程動態，顛覆了“冷休克后細菌進入生長停滯期”的傳統認知，揭示了細菌持續分裂、經歷三階段適應過程的真實圖景，并闡明了其背后的生理機制。

細菌的冷休克反應是一種在溫度驟降時啟動的保守適應性機制。研究這一過程，對于理解微生物在臨床和工業環境中的生存策略，以及開發新型抗菌藥物和優化低溫保存技術等應用，都具有重要意義。過去數十年來，人們對冷休克反應的認識主要來源于種群水平的分析。普遍認為，細菌在冷休克后會立即進入一個生長停滯階段，表現為光密度（OD）值保持不變，隨后再以降低的生長速率重新進入穩態。雖然通過組學方法已鑒定出許多與冷休克相關的關鍵蛋白，但這些蛋白如何協同調控并最終幫助細胞適應低溫，仍尚不清晰。這種局限性的根源在于，傳統的種群水平研究掩蓋了單個細胞可能存在的異質性行為。

基于成像的單細胞生理學分析，憑借其高時空分辨率和通量，已在微生物學研究中取得重要進展，例如揭示持留菌的起源、表型異質性的產生以及細菌“加法器”的尺寸調控模式等。然而，將這類成像方法應用于冷休克反應的定量分析，卻面臨著獨特的技術挑戰：誘導冷休克需要在幾分鐘內將細菌培養基從37°C迅速降至15°C以下，而普通商用顯微鏡的標準溫控系統并不具備這種快速降溫的能力。更關鍵的是，這一劇烈的降溫過程會導致嚴重的熱漂移，使顯微鏡的焦平面發生機械位移，最終造成無法挽回的失焦。

在一般的顯微成像實驗中，要獲取統計可靠的單細胞數據，需要在數小時甚至數天內對多個視野維持精確聚焦，因此必須依賴自動對焦系統來補償無法避免的焦平面漂移。現有的自動對焦方法，無論是基于圖像堆棧分析的成像法，還是利用輔助光反射來測量物鏡與樣品距離的反射法，都存在精度或工作范圍的限制，難以滿足冷休克研究中快速、大幅溫度變化所帶來的嚴苛要求。而計算擴展景深技術雖能在一定程度上擴展軸向范圍，但其對分辨率的要求和遠超其范圍的漂移量，使其同樣難以滿足本研究的需求。

圖1. 基于LUNA的冷休克反應單細胞成像平臺及光學原理圖示

為突破上述局限，本研究開發了名為LUNA的新型反射式自動對焦方法。該方法將彗差引入反射激光的衍射圖案中，通過分析光斑質心的位移來直接鎖定焦平面，無需引入額外的偏移距離，從而從根本上降低了機械噪聲。經測試，LUNA實現了低至3納米的聚焦精度，其有效工作范圍更達到物鏡焦深的40倍以上，足以應對冷休克研究所需的快速、大幅度溫度變化。借助LUNA技術，本研究得以在單細胞水平上連續監測數千個大腸桿菌在冷休克后長達十多個小時的動態變化。結果揭示，在傳統認知的“生長停滯”階段內，細菌實際上持續增殖，并經歷了一個精細調控的三階段適應過程：

第一階段（冷休克后約3分鐘內）：隨著溫度的驟降，細菌的生長速率迅速下降，其下降規律與描述化學反應速率的阿倫尼烏斯定律完美吻合，表明這主要是低溫對基礎生化反應速率的物理性抑制。

第二階段（約3至10分鐘）：當溫度降至20°C以下（已知的冷休克觸發閾值）時，生長速率的下降趨勢顯著減緩。這可能得益于細菌在常溫下就預先儲備的一些“冷休克蛋白”開始發揮作用，維持了部分關鍵的生命活動。

第三階段（10分鐘至約2小時）：溫度穩定在14°C，生長速率的下降進一步放緩，最終建立起一個新的、穩定的低速生長狀態。這一階段的特征與文獻中報道的冷休克蛋白大規模合成、蛋白質翻譯效率逐步恢復的分子過程高度一致，在單細胞層面為這些分子機制提供了動態、可視化的生理學證據。

這種單細胞層面的持續生長與種群水平上的OD值“停滯”現象看似矛盾。為此，研究團隊基于光散射理論構建的模型，指出OD值不僅取決于細菌的數量，還受單個細菌的體積和折光率影響。冷休克后，雖然細菌數量在增加，但其個體體積在減小，二者的綜合效應導致OD值在一段時間內保持平臺期。這一理論模型完美地解釋了單細胞與種群數據之間的“悖論”，并通過蛋白總量測量實驗得到了驗證。

本研究不僅顛覆了細菌冷休克反應的傳統認知，揭示了三階段適應過程以及細菌群體在環境壓力下的高度協同性與穩健性，更展示了一項核心技術的突破如何直接推動基礎生物學研究的邊界。LUNA技術憑借其卓越的精度和超大的工作范圍，已從物理原理和實測性能上充分證明了其應對極端熱漂移的可靠性。該技術不僅解決了冷休克研究的關鍵難題，更有望廣泛應用于超分辨率成像、單分子定位、大體積三維成像等前沿領域，為生命科學研究提供一種穩定、通用且可無縫集成的核心工具。

中國科學院深圳先進技術研究院定量合成生物學全國重點實驗室/合成生物學研究所研究員黃術強為本文通訊作者，課題組的項目高級工程師李思宏、博士生馬智鑫、助理研究員于躍為論文共同第一作者。中國科學院深圳先進技術研究院定量合成生物學全國重點實驗室/合成生物學研究所傅雄飛研究員、香港大學崔曉冬教授為本研究提供了重要指導。

原文鏈接：https://elifesciences.org/articles/110268

制版人： 十一

學術合作組織

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