Phytochem Anal I 從“單指標(biāo)”到“多維表型”：芪桂降脂方破解脂肪肝活性成分篩選難題 (李萍/王廣基/楊華-中國(guó)藥科大學(xué))

2026年4月6日，中國(guó)藥科大學(xué)李萍、王廣基、楊華團(tuán)隊(duì)在Phytochemical Analysis（中科院3區(qū)，IF=2.6）在線發(fā)表題為“Discovery of Active Compounds in Qigui Jiangzhi Formula for Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease by a Multidimensional Phenotypic Analysis”的研究論文。

該研究聚焦代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝病（MASLD）復(fù)雜病理進(jìn)程下中藥復(fù)方活性成分難以精準(zhǔn)識(shí)別的關(guān)鍵問(wèn)題，圍繞芪桂降脂方如何通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同調(diào)控糖代謝紊亂、脂質(zhì)代謝異常、能量代謝失衡及氧化應(yīng)激損傷展開(kāi)系統(tǒng)研究。研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了基于高內(nèi)涵成像的多維表型分析策略，突破傳統(tǒng)單指標(biāo)篩選方法的局限，成功從芪桂降脂方中鑒定出多種改善MASLD的潛在活性成分，并進(jìn)一步揭示其可能通過(guò)AGE-RAGE、AMPK、HIF-1等關(guān)鍵信號(hào)通路發(fā)揮綜合干預(yù)作用，為中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)解析及抗脂肪肝創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)提供了新的研究范式。

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【摘要】

背景：代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝病（MASLD）的發(fā)病率正持續(xù)上升。臨床研究表明，芪桂降脂方（QGJZF）可通過(guò)調(diào)節(jié)糖脂代謝通路，有效改善高脂血癥及代謝相關(guān)脂肪性肝病患者的病情。

目的：本研究旨在建立一種基于多維表型特征的篩選策略，用于篩選芪桂降脂方中能夠改善糖脂代謝異常的活性成分。

方法：本研究構(gòu)建了一種基于高內(nèi)涵成像技術(shù)的肝細(xì)胞多維表型分析方法。該方法能夠?qū)ASLD中的葡萄糖代謝、脂質(zhì)代謝、能量代謝和氧化應(yīng)激等生物學(xué)過(guò)程與細(xì)胞形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)。通過(guò)將芪桂降脂方各餾分的質(zhì)譜離子數(shù)據(jù)與多維表型數(shù)據(jù)相結(jié)合，并基于活性評(píng)分和聚類評(píng)分開(kāi)展化學(xué)-表型相關(guān)性分析，篩選芪桂降脂方中的活性成分。進(jìn)一步結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，闡明芪桂降脂方改善MASLD的潛在作用機(jī)制。

結(jié)果：在多維表型分析獲得的199個(gè)細(xì)胞表型參數(shù)中，分別有99、51、131和76個(gè)參數(shù)與MASLD中的葡萄糖代謝紊亂、脂質(zhì)代謝紊亂、能量代謝紊亂和氧化應(yīng)激相關(guān)。隨后，本研究在芪桂降脂方中鑒定出23種活性成分，這些成分能夠改善葡萄糖代謝穩(wěn)態(tài)、緩解脂質(zhì)代謝紊亂、恢復(fù)能量代謝平衡并減輕氧化損傷。活性成分與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的聯(lián)合分析結(jié)果表明，其作用機(jī)制可能涉及AGE-RAGE、MASLD相關(guān)通路、AMPK和HIF-1等信號(hào)通路。

結(jié)論：本研究提出了一種多維表型分析方法，克服了MASLD傳統(tǒng)單指標(biāo)篩選方法的局限性。利用該方法，本研究鑒定了芪桂降脂方中改善MASLD的活性成分及其關(guān)鍵作用通路。

01

研究背景及科學(xué)問(wèn)題

預(yù)計(jì)到2040年，成人代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝病（MASLD）的患病率將高達(dá)55.7%。MASLD的發(fā)病機(jī)制具有多因素特征，而代謝紊亂所形成的惡性循環(huán)是其發(fā)生和進(jìn)展的主要驅(qū)動(dòng)因素。通常認(rèn)為，MASLD的早期階段以葡萄糖代謝紊亂為主要特征。例如，過(guò)量攝入葡萄糖和果糖可誘導(dǎo)肝臟胰島素抵抗，進(jìn)而損害肝臟對(duì)葡萄糖的攝取。同時(shí)，當(dāng)脂肪組織中的胰島素抵抗增強(qiáng)脂解作用時(shí)，循環(huán)游離脂肪酸水平升高，并促進(jìn)脂質(zhì)在肝臟中堆積，從而導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂。此外，蓄積的游離脂肪酸會(huì)通過(guò)加重線粒體β-氧化負(fù)擔(dān)并損害三磷酸腺苷（ATP）的生成，引發(fā)能量代謝失衡。這些事件共同導(dǎo)致過(guò)量活性氧（ROS）的產(chǎn)生和細(xì)胞損傷。因此，亟需闡明MASLD發(fā)生與進(jìn)展的機(jī)制，為有效治療策略的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

中藥復(fù)方被認(rèn)為是治療MASLD的一種有效策略。芪桂降脂方由八味中藥組成，包括黃芪、陳皮、蒼術(shù)、肉桂、決明子、澤瀉、生山楂和絞股藍(lán)。該方在MASLD治療中顯示出潛在療效。已有研究表明，其作用機(jī)制可能與激活A(yù)MPK/SIRT1信號(hào)軸有關(guān)，該信號(hào)軸可上調(diào)TFEB介導(dǎo)的自噬-溶酶體通路，促進(jìn)肝細(xì)胞中脂滴的清除，并減少肝臟脂質(zhì)蓄積。近期研究已闡明芪桂降脂方對(duì)脂質(zhì)代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用。然而，芪桂降脂方中改善葡萄糖代謝紊亂、能量代謝失衡和氧化應(yīng)激的活性成分仍不明確。因此，有必要建立一種適用于MASLD多維病理過(guò)程的表征方法。

與基于靶點(diǎn)的篩選相比，表型篩選是新藥研發(fā)中的重要策略。表型藥物發(fā)現(xiàn)是指在不預(yù)先了解藥物靶點(diǎn)的情況下，基于可量化的表型終點(diǎn)篩選候選化合物。表型篩選非常適合用于中藥復(fù)方多成分體系中活性成分的發(fā)現(xiàn)。高內(nèi)涵成像技術(shù)能夠在單次實(shí)驗(yàn)甚至單個(gè)細(xì)胞水平提取數(shù)百至數(shù)千個(gè)形態(tài)學(xué)參數(shù)。高內(nèi)涵成像技術(shù)所獲得的多維參數(shù)已廣泛應(yīng)用于中藥活性成分的鑒定。例如，AnnoTCM平臺(tái)通過(guò)結(jié)合高內(nèi)涵成像技術(shù)和代謝組學(xué)，從保元湯中鑒定出16種抗炎成分。此外，高內(nèi)涵成像技術(shù)也已在斑馬魚(yú)模型中的表型藥物發(fā)現(xiàn)研究中得到驗(yàn)證，并成功用于從仲景方中篩選抗炎化合物。因此，借助高內(nèi)涵成像獲得的多維表型數(shù)據(jù)，有望全面揭示中藥復(fù)方通過(guò)多成分調(diào)控疾病多個(gè)生物學(xué)過(guò)程的作用方式。

本研究設(shè)計(jì)了一種多維表型篩選策略，用于篩選芪桂降脂方中的活性成分。該策略針對(duì)MASLD的四個(gè)關(guān)鍵病理過(guò)程，即葡萄糖代謝紊亂、脂質(zhì)代謝紊亂、能量代謝紊亂和細(xì)胞氧化應(yīng)激，構(gòu)建了定量化的多維表型模塊。隨后，這些表型定量模塊被用于分析芪桂降脂方對(duì)多步驟病理生理過(guò)程的改善作用。通過(guò)化學(xué)-表型相關(guān)性分析，本研究鑒定出芪桂降脂方中18種可改善葡萄糖代謝平衡的化合物。同時(shí)，有19種化合物可通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂緩解疾病。在能量代謝方面，有17種化合物可恢復(fù)能量代謝平衡。此外，有16種化合物可減輕MASLD中的氧化應(yīng)激損傷。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)被用于預(yù)測(cè)活性成分的潛在作用機(jī)制。結(jié)果顯示，這些化合物可通過(guò)調(diào)節(jié)AGE-RAGE、胰島素信號(hào)和胰高血糖素信號(hào)等信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)增強(qiáng)葡萄糖穩(wěn)態(tài)；通過(guò)調(diào)控MASLD相關(guān)通路改善脂質(zhì)代謝紊亂；通過(guò)協(xié)調(diào)AMPK和mTOR信號(hào)實(shí)現(xiàn)能量平衡；并通過(guò)激活FoxO和HIF-1通路減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。綜上，本研究通過(guò)一種高效的多維表型方法，證明了芪桂降脂方及其活性成分在MASLD治療中的調(diào)節(jié)作用。本研究認(rèn)為，多維表型分析方法可應(yīng)用于中藥復(fù)方活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點(diǎn)

3.1 高糖誘導(dǎo)的肝細(xì)胞代謝紊亂模型

為系統(tǒng)評(píng)估代謝變化，本研究采用45、50、55、60或65 mM葡萄糖處理HepG2細(xì)胞24 h。結(jié)果表明，55 mM葡萄糖能夠穩(wěn)定誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生一系列代謝紊亂，包括葡萄糖攝取受損、脂滴堆積增加、ATP含量下降以及ROS水平升高。因此，本研究選擇55 mM葡萄糖作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳誘導(dǎo)濃度。隨后，研究進(jìn)一步考察代謝功能障礙的時(shí)間變化過(guò)程，采用55 mM葡萄糖處理HepG2細(xì)胞，并在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)（0、3、6、9、12、15和24 h）評(píng)估其變化。隨著高糖暴露時(shí)間延長(zhǎng)，代謝異常呈時(shí)間依賴性加重，提示代謝紊亂和氧化應(yīng)激可能形成自我維持的惡性循環(huán)。因此，本研究選擇55 mM葡萄糖處理24 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳條件（圖1）。

55 mM葡萄糖誘導(dǎo)顯著降低了HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗。同時(shí)，55 mM葡萄糖可導(dǎo)致總膽固醇（TC）和總甘油三酯（TG）水平升高。Nile Red和油紅O染色均證實(shí)細(xì)胞內(nèi)存在明顯脂滴堆積。此外，55 mM葡萄糖還觸發(fā)顯著的線粒體功能障礙，表現(xiàn)為線粒體膜電位（MMP）下降和ROS水平升高。綜上，這些結(jié)果證實(shí)了所建立代謝紊亂模型的有效性。

圖1 高糖（55 mM）誘導(dǎo)的肝細(xì)胞代謝紊亂模型。
（A）不同時(shí)間點(diǎn)HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取水平的代表性熒光圖像。（B）不同時(shí)間點(diǎn)HepG2細(xì)胞相對(duì)葡萄糖攝取水平的定量分析（n=3）。（C）不同時(shí)間點(diǎn)HepG2細(xì)胞脂滴堆積的代表性熒光圖像。（D）不同時(shí)間點(diǎn)HepG2細(xì)胞相對(duì)脂滴堆積水平的定量分析（n=3）。（E）不同時(shí)間點(diǎn)HepG2細(xì)胞ATP含量的代表性熒光圖像。（F）不同時(shí)間點(diǎn)HepG2細(xì)胞相對(duì)ATP含量的定量分析（n=3）。（G）不同時(shí)間點(diǎn)HepG2細(xì)胞ROS水平的代表性熒光圖像。（H）不同時(shí)間點(diǎn)HepG2細(xì)胞相對(duì)ROS水平的定量分析（n=3）。統(tǒng)計(jì)分析中，所有數(shù)值均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*表示模型組與對(duì)照組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

3.2 55 mM葡萄糖可顯著影響HepG2細(xì)胞的多維表型變化

細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和功能的完整性對(duì)于維持代謝穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。代謝功能障礙通常與線粒體損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接觸異常有關(guān)。根據(jù)上述方法，本研究對(duì)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞膜、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行了多重染色。隨后，對(duì)正常組和55 mM葡萄糖組的HepG2細(xì)胞進(jìn)行高內(nèi)涵成像。利用Harmony 4.9軟件從三個(gè)細(xì)胞器中共提取199個(gè)表型參數(shù)，包括熒光強(qiáng)度、形態(tài)學(xué)特征和紋理特征。其中，細(xì)胞膜參數(shù)39個(gè)，線粒體參數(shù)80個(gè)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參數(shù)80個(gè)。基于多維表型分析結(jié)果，在55 mM葡萄糖作用下，HepG2細(xì)胞中有94個(gè)表型參數(shù)發(fā)生顯著變化。為更直觀地展示多維表型差異信息，本研究采用了非線性降維技術(shù)。t-SNE是一種將高維數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換至低維空間的方法。結(jié)果顯示，對(duì)照組與55 mM葡萄糖組呈現(xiàn)明顯聚類。此外，本研究還分別分析了細(xì)胞膜、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的多維表型參數(shù)，結(jié)果同樣顯示出顯著聚類。

圖2 HepG2細(xì)胞的多維表型分析。
（A）正常條件和高糖條件下HepG2細(xì)胞的表型圖像。（B）HepG2細(xì)胞表型圖像的分析流程。（C）MASLD的多維表型分析策略。（D）MASLD相關(guān)表型參數(shù)的聚類分析。（E）MASLD的多維表型圖譜。

3.3 HepG2細(xì)胞的多維表型分析

本研究將Pearson相關(guān)系數(shù)引入多維表型分析方法，用于將HepG2細(xì)胞的代謝功能變化與多維表型分析結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)。Pearson相關(guān)系數(shù)可用于衡量?jī)蓚€(gè)連續(xù)變量之間線性關(guān)系的強(qiáng)度和方向。本研究采集了不同濃度葡萄糖刺激下HepG2細(xì)胞的高內(nèi)涵成像數(shù)據(jù)。如圖2C所示，選取R2≥0.3的表型參數(shù)作為與MASLD四個(gè)關(guān)鍵病理過(guò)程密切相關(guān)的參數(shù)。隨后，分別分析多維表型參數(shù)與葡萄糖代謝紊亂（2-NBDG熒光強(qiáng)度）、脂質(zhì)代謝紊亂（Bodipy熒光強(qiáng)度）、能量代謝紊亂（ATP Red-1熒光強(qiáng)度）和氧化應(yīng)激（DCFH-DA熒光強(qiáng)度）之間的相關(guān)性。之后，采用t-SNE對(duì)這些高度相關(guān)的參數(shù)進(jìn)行分析。

結(jié)果顯示，199個(gè)表型參數(shù)分別與葡萄糖代謝紊亂、脂質(zhì)代謝紊亂、能量代謝紊亂和氧化應(yīng)激存在相關(guān)性。此外，進(jìn)一步對(duì)這些MASLD相關(guān)參數(shù)集進(jìn)行t-SNE降維分析后，觀察到55 mM葡萄糖組與對(duì)照組之間出現(xiàn)明顯聚類。說(shuō)明這些多維表型參數(shù)能夠有效區(qū)分HepG2細(xì)胞的不同狀態(tài)。

結(jié)果顯示，99個(gè)參數(shù)與葡萄糖代謝紊亂高度相關(guān)，51個(gè)參數(shù)與脂質(zhì)代謝紊亂高度相關(guān)，131個(gè)參數(shù)與能量代謝紊亂高度相關(guān)，76個(gè)參數(shù)與氧化應(yīng)激高度相關(guān)。通過(guò)整合四個(gè)病理過(guò)程中的參數(shù)，該圖譜為表征肝細(xì)胞代謝功能障礙提供了一個(gè)綜合框架。

3.4 芪桂降脂方提取物改善MASLD異常細(xì)胞模型

芪桂降脂方提取物（10–100 μg/mL）處理后未觀察到明顯細(xì)胞毒性，各測(cè)試濃度下細(xì)胞活力均保持在90%以上。隨后，本研究在10、30和100 μg/mL濃度下評(píng)估芪桂降脂方對(duì)MASLD的改善作用。結(jié)果顯示，芪桂降脂方可改善HepG2細(xì)胞的代謝功能，例如提高葡萄糖消耗和葡萄糖攝取水平。同時(shí)，芪桂降脂方減少了脂滴堆積，并降低了細(xì)胞內(nèi)TC和TG水平。此外，芪桂降脂方能夠增加55 mM葡萄糖刺激下HepG2細(xì)胞中的ATP含量，并防止氧化應(yīng)激損傷。

3.5 芪桂降脂方的化學(xué)成分表征

芪桂降脂方中的化學(xué)成分是其發(fā)揮藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。為表征其非揮發(fā)性成分，本研究采用UPLC-Q-TOF MS進(jìn)行分析。經(jīng)優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件后，在正、負(fù)離子模式下采集MS1和MS2數(shù)據(jù)。利用MassHunter Qualitative Analysis B.10.0軟件，本研究共鑒定出117種化合物，包括57種黃酮類、11種酚類、10種蒽醌類、10種萜類、7種苯丙素類、5種氨基酸、5種有機(jī)酸、3種生物堿、2種核苷、2種糖類以及5種其他類型化合物。

圖3 芪桂降脂方的化學(xué)成分表征及藥理作用驗(yàn)證。
（A）芪桂降脂方干預(yù)后HepG2細(xì)胞中2-NBDG、Bodipy、ATP Red-1和DCFH-DA的代表性熒光圖像。（B）芪桂降脂方干預(yù)后HepG2細(xì)胞的相對(duì)葡萄糖攝取水平（n=6）。（C）芪桂降脂方干預(yù)后HepG2細(xì)胞的相對(duì)脂滴堆積水平（n=6）。（D）芪桂降脂方干預(yù)后HepG2細(xì)胞中TC的相對(duì)含量（n=6）。（E）芪桂降脂方干預(yù)后HepG2細(xì)胞中TG的相對(duì)含量（n=6）。（F）芪桂降脂方干預(yù)后HepG2細(xì)胞的相對(duì)ATP含量（n=6）。（G）芪桂降脂方干預(yù)后HepG2細(xì)胞的相對(duì)ROS水平（n=6）。（H）芪桂降脂方在正、負(fù)離子模式下的總離子流圖。（I）芪桂降脂方化學(xué)成分的分類注釋。統(tǒng)計(jì)分析中，所有數(shù)值均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*表示模型組與對(duì)照組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；<0.05，#<0.01，##<0.001。

3.6 芪桂降脂方活性成分篩選

本研究采用自動(dòng)制備液相色譜系統(tǒng)，以時(shí)間觸發(fā)模式對(duì)芪桂降脂方提取物進(jìn)行分離。共收集到128個(gè)具有梯度極性的餾分（QGJZF 1–128），并建立了芪桂降脂方餾分庫(kù)。隨后，采用UPLC-Q-TOF MS采集各餾分的MS1數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，不同餾分之間分子離子峰存在明顯差異，說(shuō)明該方法能夠有效分離芪桂降脂方中具有不同極性的化合物。研究從各餾分的總離子流圖中提取特征峰，并整合其峰數(shù)、保留時(shí)間（RT）、質(zhì)荷比（m/z）及對(duì)應(yīng)餾分信息。隨后進(jìn)行峰對(duì)齊以篩選高質(zhì)量特征，其中m/z匹配容差≤10 ppm，RT匹配容差≤0.3 min。僅保留至少在兩個(gè)餾分中檢測(cè)到的特征，最終生成包含22,583個(gè)特征離子的化學(xué)數(shù)據(jù)集。基于10 μg/mL的安全濃度，本研究使用128個(gè)芪桂降脂方餾分處理高糖暴露的HepG2細(xì)胞，從而構(gòu)建了包含17,280張圖像及其MASLD相關(guān)參數(shù)矩陣的表型圖像數(shù)據(jù)集。

化學(xué)-表型相關(guān)性分析通過(guò)活性評(píng)分和聚類評(píng)分鑒定芪桂降脂方中的活性成分。這些評(píng)分通過(guò)將芪桂降脂方各餾分的質(zhì)譜離子數(shù)據(jù)與多維表型數(shù)據(jù)相結(jié)合獲得。離子水平活性通過(guò)兩步評(píng)分流程進(jìn)行評(píng)估。首先，利用遍歷算法查找所有含有該離子的餾分，并根據(jù)MASLD相關(guān)歸一化表型參數(shù)絕對(duì)值的均值為每個(gè)餾分賦予“活性評(píng)分”。隨后，通過(guò)匯總所有對(duì)應(yīng)餾分的活性評(píng)分計(jì)算離子活性評(píng)分。Z分?jǐn)?shù)分布超過(guò)第80百分位的離子被初步定義為活性離子。為進(jìn)一步優(yōu)化篩選結(jié)果，本研究利用共享同一離子的餾分之間的Pearson相關(guān)性計(jì)算“聚類評(píng)分”，以反映表型調(diào)控的一致性。聚類評(píng)分高于0.8的離子被定義為高置信度活性特征。詳細(xì)篩選流程見(jiàn)圖4A。

篩選結(jié)果顯示，芪桂降脂方處理組的AS Z分?jǐn)?shù)分布與模型組存在明顯差異。這一現(xiàn)象在四個(gè)關(guān)鍵病理過(guò)程中均一致出現(xiàn)，包括葡萄糖代謝紊亂、脂質(zhì)代謝紊亂、能量代謝紊亂和氧化應(yīng)激。這些結(jié)果提示，芪桂降脂方可能有效改善上述病理表型。隨后，本研究采用CS評(píng)估候選特征離子的表型相關(guān)性。最終，分別在四個(gè)關(guān)鍵病理過(guò)程中鑒定出717、695、700和751個(gè)活性特征離子。所有篩選結(jié)果均通過(guò)穩(wěn)健性評(píng)估，SSMD值均大于1。

本研究從芪桂降脂方中鑒定出作用于MASLD四個(gè)關(guān)鍵病理過(guò)程的活性成分。18種化合物，包括毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素等，可改善葡萄糖代謝穩(wěn)態(tài)；19種化合物，包括川陳皮素、蘆丁等，可緩解脂質(zhì)代謝紊亂；17種化合物，包括決明素、山柰酚-3-O-蕓香糖苷等，可恢復(fù)能量代謝平衡；16種化合物，包括檸檬酸、異美橙皮內(nèi)酯等，可減輕氧化應(yīng)激損傷。

圖4 芪桂降脂方活性成分篩選。
（A）基于AS和CS的兩步評(píng)分策略。（B）特征離子AS Z分?jǐn)?shù)的累積分布圖（葡萄糖代謝紊亂-細(xì)胞膜）。（C）特征離子AS Z分?jǐn)?shù)的累積分布圖（葡萄糖代謝紊亂-線粒體）。（D）特征離子AS Z分?jǐn)?shù)的累積分布圖（葡萄糖代謝紊亂-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）。（E）特征離子AS Z分?jǐn)?shù)的散點(diǎn)圖（葡萄糖代謝紊亂-細(xì)胞膜）。（F）特征離子AS Z分?jǐn)?shù)的散點(diǎn)圖（葡萄糖代謝紊亂-線粒體）。（G）特征離子AS Z分?jǐn)?shù)的散點(diǎn)圖（葡萄糖代謝紊亂-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）。（H）葡萄糖代謝紊亂相關(guān)活性特征離子的韋恩圖。（I）脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)活性特征離子的韋恩圖。（J）能量代謝紊亂相關(guān)活性特征離子的韋恩圖。（K）氧化應(yīng)激相關(guān)活性特征離子的韋恩圖。

圖5 芪桂降脂方潛在活性成分的功能注釋。

3.7 芪桂降脂方活性成分藥理作用驗(yàn)證

本研究在10 μM濃度下檢測(cè)活性成分的體外藥理作用。結(jié)果顯示，這些化合物可增強(qiáng)高糖暴露HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗，減少細(xì)胞內(nèi)脂滴堆積，恢復(fù)ATP水平，并清除過(guò)量ROS。

據(jù)此，本研究進(jìn)一步選擇毛蕊異黃酮、決明素、4-甲基肉桂酸和6-去甲氧基橘皮素，在原代小鼠肝細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。在1–20 μM濃度范圍內(nèi)，這四種化合物均以劑量依賴性方式發(fā)揮上述藥理作用。

3.8 芪桂降脂方活性成分的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

基于篩選得到的全部活性成分，本研究將其潛在靶點(diǎn)與MASLD相關(guān)疾病靶點(diǎn)取交集，以探索其潛在機(jī)制。韋恩分析鑒定出與四個(gè)病理過(guò)程相關(guān)的交集靶點(diǎn)：葡萄糖代謝紊亂相關(guān)靶點(diǎn)344個(gè)，脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)靶點(diǎn)338個(gè)，能量代謝紊亂相關(guān)靶點(diǎn)331個(gè)，氧化應(yīng)激相關(guān)靶點(diǎn)334個(gè)。隨后，利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建各病理過(guò)程的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)拓?fù)鋵W(xué)分析分別鑒定出48、62、52和56個(gè)核心靶點(diǎn)。這些結(jié)果表明，活性成分通過(guò)協(xié)同調(diào)控這些關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮作用，并在多個(gè)病理過(guò)程中產(chǎn)生綜合干預(yù)效應(yīng)。

通路富集分析揭示了活性成分調(diào)控多個(gè)病理過(guò)程的潛在機(jī)制。在葡萄糖代謝方面，分析結(jié)果提示其涉及AGE-RAGE、胰島素和胰高血糖素信號(hào)通路。對(duì)于脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)，這些化合物可能通過(guò)促進(jìn)脂解并調(diào)控脂質(zhì)代謝相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮治療作用。在能量穩(wěn)態(tài)方面，mTOR、AMPK和FoxO信號(hào)通路被鑒定為調(diào)控細(xì)胞能量合成、利用和平衡的關(guān)鍵通路。決明素等化合物可調(diào)節(jié)活性氧代謝和HIF-1信號(hào)，從而改善氧化應(yīng)激損傷。綜上，本研究鑒定了芪桂降脂方中能夠改善MASLD不同病理過(guò)程的活性成分。為更直觀地展示芪桂降脂方抗MASLD的多成分調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，本研究基于活性成分信息構(gòu)建了網(wǎng)絡(luò)。基于該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可以高效識(shí)別活性成分調(diào)控疾病改善的作用形式。

圖6 活性成分的藥效學(xué)驗(yàn)證及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究。
（A）活性成分促進(jìn)葡萄糖消耗的藥效學(xué)驗(yàn)證（n=3）。（B）芪桂降脂方藥物靶點(diǎn)與葡萄糖代謝紊亂相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖。（C，D）葡萄糖代謝紊亂核心靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析。（E）芪桂降脂方抗MASLD的多成分調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。統(tǒng)計(jì)分析中，所有數(shù)值均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*表示模型組與對(duì)照組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；<0.05，#<0.01，##<0.001。

【Citation】:Xu X, Zhou F, Wu Z, et al. Discovery of Active Compounds in Qigui Jiangzhi Formula for Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease by a Multidimensional Phenotypic Analysis.Phytochem Anal. Published online April 22,2026.

【貢獻(xiàn)】★★★★★

本研究通過(guò)建立一種多維表型篩選策略，解決了傳統(tǒng)單指標(biāo)篩選方法在代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝病（MASLD）研究中的固有局限。該方法能夠捕捉MASLD病理過(guò)程復(fù)雜且多因素的特征，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物療效更全面的評(píng)估。將該策略應(yīng)用于中藥復(fù)方芪桂降脂方后，本研究成功鑒定出多種生物活性成分。進(jìn)一步結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這些成分可能通過(guò)同時(shí)靶向葡萄糖代謝紊亂、脂質(zhì)代謝紊亂、能量代謝紊亂和氧化應(yīng)激等多個(gè)病理過(guò)程來(lái)緩解MASLD。其協(xié)同作用可能通過(guò)AGE-RAGE、NAFLD、AMPK和HIF-1等關(guān)鍵信號(hào)通路介導(dǎo)。通過(guò)實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)疾病相關(guān)表型的同步評(píng)價(jià)，該多維方法克服了單指標(biāo)檢測(cè)的還原論局限，并為解析中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了一種新的系統(tǒng)性研究范式。

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