J Clin Invest I 一個基因突變，如何讓造血干細胞“失控”走向骨髓纖維化？(趙寶兵-山東大學藥學院/蔡志剛-天津醫科大學)

2026年4月23日，山東大學藥學院趙寶兵團隊聯合天津醫科大學蔡志剛團隊等，在The Journal of clinical investigation（中科院1區，IF=13.6）雜志發表題為 “Physiological MplW514L expression in hematopoietic stem cell causes an essential thrombocythemia and progressive myelofibrosis” 的研究論文。

▼編者按:

該研究聚焦 MPLW515L 突變陽性骨髓增殖性腫瘤（MPN）的疾病起源與進展機制，構建了模擬人類 MPLW515L 突變的 MplW514L 生理性敲入小鼠模型，系統揭示了 MplW514L 突變可在造血干細胞中驅動本態性血小板增多癥（ET）樣 MPN 表型，并隨疾病進展誘發骨髓纖維化。研究進一步發現，MplW514L 突變并非單純增強造血干細胞的競爭性重建能力，而是重塑造血干細胞命運，顯著擴增具有巨核細胞譜系偏向的 CD201? 造血干細胞亞群，從而促進血小板異常增多和巨核細胞異常增生。值得注意的是，JAK2 抑制劑 Fedratinib 雖可緩解部分 MPN 病理表型，卻無法清除疾病起始性造血干細胞，提示針對 MPL 突變相關 MPN 的治療仍需進一步關注 JAK/STAT 非依賴性通路及疾病起始細胞本身。該研究為理解 MPLW515L 突變陽性 MPN 從 ET 向骨髓纖維化進展的機制提供了重要體內模型，也為開發更精準的干預策略提供了新的理論依據。

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【摘要】

MPL 蛋白第 515 位色氨酸（W515）突變是促進 BCR/ABL 陰性骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasms，MPNs）的關鍵驅動突變之一，但其在生理背景下對造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）以及 MPN 相關血液學異常的影響尚未得到研究。在本研究中，我們建立了一個 MplW514L 敲入小鼠模型，該模型在造血過程中很大程度上模擬人類 MPLW515L 突變。突變小鼠出現類似原發性血小板增多癥（essential thrombocythemia，ET）的 MPN 表型，表現為巨核細胞生成過多、血小板增多以及進行性骨髓纖維化。機制上，我們觀察到由 MplW514L 條件化的 HSC 區室具有獨特的疾病起始能力，但相較于野生型對照，并未表現出明顯的競爭性重建優勢。值得注意的是，單細胞分析和流式細胞術結果支持：MplW514L 表達導致 HSC 池內偏向巨核細胞譜系命運的干細胞顯著擴增。最后，JAK2 抑制劑治療在表型上緩解了 ET 征象，但未能清除疾病起始性 HSCs。這些發現闡明了 HSC 中 MPLW515L 突變生理性表達的病因學意義，同時也提供了一個有價值的體內模型，用于評估 MPLW515L 陽性 MPN 患者的潛在治療方案。

關鍵詞：骨髓增殖性白血病病毒癌基因（MPL）；血小板增多；骨髓纖維化；原發性血小板增多癥（ET）；骨髓增殖性腫瘤（MPN）。

01

研究背景及科學問題

經典骨髓增殖性腫瘤（MPNs），也稱為 BCR-ABL 陰性 MPNs，包括真性紅細胞增多癥（polycythemia vera，PV）、原發性血小板增多癥（ET）和原發性骨髓纖維化（primary myelofibrosis，PMF）。MPNs 中常見的分子事件是 Janus 激酶 2（JAK2）、骨髓增殖性白血病病毒癌基因（MPL）或鈣網蛋白（CALR）基因中的互斥性突變。這些體細胞突變導致 HSC 的克隆性擴增，并伴隨單系或多系細胞增生。ET 的特征是血小板計數升高并伴有巨核細胞增生；而 PMF 則是一種具有臨床和生物學異質性的疾病，其定義性特征為骨髓纖維化和巨核細胞增生。

MPL（myeloproliferative leukemia virus）是一種原癌基因，編碼血小板生成素（thrombopoietin，TPO）的受體。在生理水平上，MPL 的正常表達是驅動巨核細胞分化和血小板生成的主要因素。然而，獲得性激活型 MPL 突變可見于 5%–10% 的 PMF 患者和 1%–4% 的 ET 患者。最常見的突變發生在色氨酸 W515 位點，該位點位于 MPL 膜受體蛋白跨膜結構域與胞質結構域的交界處，可使 MPL 在不依賴 TPO 結合的情況下形成活化的二聚體構象。W515L 和 W515K 是 MPN 中最主要的突變類型，而其他替換突變如 W515R、W515A 和 W515G 則較少見。近年來，在 MPN 中也罕見發現若干非常規突變，位于跨膜結構域（S505）、胞外結構域（S204 或 E230）或胞內結構域（Y591）。這些突變在 ET 中通常為雜合狀態，但在疾病進展為骨髓纖維化（MF）過程中可轉變為純合狀態。

在 MPN 患者中，可在 CD34+CD38- HSCs 以及成熟細胞譜系中檢測到 MPLW515L。MPLW515L 在細胞系中過表達可導致細胞因子非依賴性增殖，并使 JAK/STAT 通路持續激活。此外，來自 MPN 患者的 MPLW515L 陽性 CD34+ 細胞在非肥胖糖尿病/重癥聯合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠模型中表現出長期重建能力。逆轉錄病毒轉導的 MPLW515L 模型會發生侵襲性 MPN，其特征是顯著的血小板增多、白細胞增多和骨髓纖維化。然而，由于缺乏合適模型能夠在生理表達水平下忠實模擬人類 MPN 中的 MPL 變異，既往研究未能鑒定疾病起始性造血細胞區室，也無法精確解析 MplW515L 等位基因所導致的病理結果。

鑒于激活的 JAK2 信號在 MPN 發病機制中的核心作用，JAK2 抑制劑已被廣泛用于 MPN 的臨床治療。盡管這些抑制劑能夠有效縮小脾臟、緩解 MPN 相關癥狀并延長患者生存期，但在大多數患者中，它們不能誘導有意義的分子緩解，也不能逆轉疾病進程。靜息 HSCs 中疾病起始細胞的持續存在，是復發和耐藥的主要原因。因此，闡明 MPLW515L-HSC 的功能特征及其驅動疾病細胞的潛在機制，對于為 MPL 變異相關 MPN 提供有效治療至關重要。

在本研究中，我們構建了 MplW514L（模擬人類 MPLW515L）敲入小鼠，其中 MplW514L 的表達受內源性 Mpl 啟動子控制。我們對 MplW514L 等位基因在造血干細胞和祖細胞中的表型與功能影響進行了詳細分析，并在體內評估了 JAK2 抑制劑對 MPL 變異相關 MPN 的療效。

02

重要發現及亮點

MplW514L 敲入小鼠表現出 ET 相關 MPN 表型

我們通過 CRISPR/Cas9 介導的小鼠胚胎干細胞基因工程，構建了 MplW514L 條件性敲入等位基因，該突變相當于人類 MPL 中的 W515L 突變。將 floxed MplW514L 小鼠（FL/FL）與 Vav-Cre 轉基因小鼠雜交，以在造血系統中誘導受內源性 Mpl 啟動子控制的 MplW514L 表達（圖 1A）。小鼠與人類 MPL 蛋白序列總體同源性約為 80%，其中小鼠第 514 位色氨酸對應于人類 W515（補充圖 1A）。通過小鼠尾部 PCR 鑒定出表達 MplW514L 的雜合小鼠（FL/+；Vav-Cre，W514L/+）和純合小鼠（FL/FL；Vav-Cre，W514L/W514L）（圖 1B）。這些小鼠的 Mpl mRNA 水平與野生型（+/+，WT）同窩對照相近，提示靶向 W514L 突變的構建策略并未破壞內源性 Mpl 基因表達（圖 1C）。

為確定 MplW514L 小鼠中 Vav-Cre 重組頻率，我們使用 Mpl 引物對 WT、W514L/+ 和 W514L/W514L 小鼠骨髓（BM）cDNA 來源的 PCR 產物進行測序。通過擴增混合質粒（分別編碼 MplW514L 與 Mpl）建立標準曲線，從而確定 MplW514L 突變等位基因與 WT 等位基因的比例（補充圖 1B-C）。結果證實，雜合 MplW514L 表達小鼠中的 Vav-Cre 重組效率約為 50%，純合 MplW514L 表達小鼠中接近 100%（圖 1D-E）。此外，免疫印跡分析顯示，在 MplW514L 表達的 BM 細胞中，STAT5 和 STAT3 呈等位基因劑量依賴性的組成性磷酸化，提示突變 Mpl 蛋白發生過度激活（圖 1F）。

所有表達雜合或純合 MplW514L 的小鼠在 2 月齡時均較 WT 對照表現出顯著升高的血小板計數，這是人類 ET 的標志性特征。純合 MplW514L 表達小鼠的血小板增多更為明顯，并隨年齡增長持續存在（圖 1G）。為評估 MplW514L 表達的長期血液學后果，我們對小鼠進行了最長 48 周的監測。老齡 MplW514L 小鼠持續表現出 ET 表型（圖 1G 和補充表 S2）。此外，MplW514L 敲入小鼠的血清 TPO 水平與其 WT 同窩對照相當（補充圖 1D）。

年輕小鼠的白細胞和紅細胞計數未發生顯著改變（圖 1H-J）。值得注意的是，老齡 MplW514L 小鼠（10 月齡）出現嚴重貧血，表現為紅細胞計數和血細胞比容顯著降低（圖 1I-J）。此外，這些老齡 MplW514L 小鼠的總白細胞計數輕度升高，主要源于中性粒細胞和單核細胞水平升高（補充圖 1E-F），提示其髓系輸出出現年齡相關性轉變。

老齡 MplW514L 敲入小鼠進展為骨髓纖維化

年輕 MplW514L 小鼠的體重或脾重未見明顯變化，而骨髓細胞計數略有增加（補充圖 2A）。然而，流式細胞術分析顯示，年輕雜合和純合 MplW514L 小鼠骨髓中的 CD41+ 細胞顯著增加（補充圖 2B）。組織學分析也顯示，MplW514L 表達骨髓中出現明顯巨核細胞增生，其特征為成簇巨核細胞的數量和大小增加（補充圖 2C）。

值得注意的是，與 WT 同窩對照相比，老齡 MplW514L 小鼠表現出體重和骨髓細胞計數降低（圖 2A-B）。老齡 MplW514L 表達骨髓的主要特征是巨核細胞譜系增生，并伴有巨核細胞異型性和巨核細胞頻繁緊密成簇。組織學檢查顯示細胞體積增大、細胞核高度分葉或不規則折疊，并偶見核質發育不同步，這些均符合骨髓纖維化的典型特征（圖 2C）。老齡雜合和純合 MplW514L 小鼠骨髓中 CD41+ 細胞比例顯著升高，表明這些老齡小鼠中巨核細胞生成和血小板增多持續存在（圖 2D 和補充圖 2D）。

與外周血紅細胞水平下降一致，我們發現老齡 MplW514L 小鼠骨髓中的紅系母細胞（TER119+）顯著減少（圖 2E 和補充圖 2D）。此外，老齡雜合和純合 MplW514L 表達小鼠骨髓中的 Gr1+Mac1+ 細胞也升高（圖 2F 和補充圖 2D）。

老齡 MplW514L 小鼠出現明顯脾腫大，且呈等位基因劑量依賴性（圖 2G）。流式細胞術分析顯示，與 WT 同窩對照相比，這些 MplW514L 小鼠脾臟中的 LSK（Lineage-Sca1+cKit+）群體顯著增加，并伴隨巨核細胞（CD41+）、紅系（TER119+）和髓系（Gr1+Mac1+）譜系明顯擴增（圖 2H 和補充圖 2E）。脾臟切片顯示，老齡雜合 MplW514L 表達小鼠的脾結構被破壞，并伴有顯著巨核細胞擴增；純合 MplW514L 表達小鼠中這一現象更為嚴重（圖 2I）。這些數據提示，老齡 MplW514L 小鼠發生了髓外造血。鑒于 ET 可能進展為骨髓纖維化，我們進行了網狀纖維染色，并觀察到老齡 MplW514L 小鼠骨髓和脾臟中網狀纖維顯著增加（圖 2C 和 2I）。半定量評分系統（0–3）顯示，與雜合 MplW514L 表達小鼠和野生型對照相比，MplW514L 小鼠的纖維化評分顯著升高，表明純合突變體強烈進展為骨髓纖維化（圖 2J 和補充表 S3）。

攜帶 MplW514L 的 MPN 起始細胞富集于含 HSC 的 LSK 區室，而非含 GMP 的 LK 區室

為確定 MplW514L 驅動的 MPN 表型是否可移植，我們將來自 MplW514L 小鼠或其 WT 同窩對照的總骨髓細胞移植入經致死劑量照射的野生型小鼠。接受 MplW514L 表達 BM 的受體小鼠表現出原代 MplW514L 小鼠中的表型，包括血小板升高（補充圖 3A）、明顯脾腫大并伴隨巨核細胞、紅系和髓系細胞顯著擴增（補充圖 3B-D），以及骨髓中巨核細胞擴增（補充圖 3E）。在二次移植受體中也觀察到血小板升高（補充圖 3F）。這些結果表明，MplW514L 小鼠中的血小板增多和 ET 表型具有細胞自主性。

我們評估了 MplW514L 小鼠骨髓中的造血干細胞。流式細胞術分析顯示，與 WT 同窩對照相比，MplW514L 小鼠的 LSK 和 SLAM-LSK（CD150+CD48- LSK）群體顯著增加（圖 3A-B），提示 MplW514L 突變對 LSK 擴增具有顯著影響。

為鑒定包含 MplW514L 驅動 MPN 疾病起始細胞的造血發育階段，我們分別從 MplW514L 小鼠及其 WT 同窩對照骨髓中分選 LSK 和 LK（Lineage-Sca1-cKit+）群體，并移植入經致死劑量照射的受體小鼠（圖 3C）。接受 MplW514L 表達 LSK 細胞的受體發生 ET 樣 MPN，其特征為血小板水平升高（圖 3D）、骨髓中巨核細胞和 LSK 細胞增加（圖 3E-F），并伴有異常巨核細胞增生（圖 3G），從而復制了原代小鼠中的 ET 表型。相反，接受 MplW514L 表達 LK 細胞的受體在長達 4 個月內未發生 ET 樣 MPN（圖 3D-G）。我們還使用 LSK 群體受體來源的未分選 BM 細胞進行二次移植，發現受體仍表現出血小板水平升高（補充圖 3G）。這些發現證明，表達 MplW514L 的 LSK 細胞，而非已定向分化的祖細胞，能夠在體內起始并維持 MPN。

為確定 MplW514L 是否賦予 LSK 區室優勢，我們進行了競爭性骨髓移植實驗。我們將混合骨髓移植入經致死劑量照射的受體小鼠（表達 CD45.1），其中來自 MplW514L 小鼠或其 WT 同窩對照（表達 CD45.2）的 LSK 細胞與 WT 小鼠（表達 CD45.2 和 CD45.1）細胞的比例分別為 6:4（補充圖 3H）。接受 MplW514L 表達 BM 的受體出現 ET 表型，其特征為外周血血小板升高（圖 3H）。我們對這些嵌合小鼠監測長達 6 個月，發現各組外周血中 CD45.2+ BM 來源細胞比例保持穩定（圖 3I）。與接受 WT BM 的組相比，MplW514L 表達 BM 嵌合小鼠骨髓中的巨核細胞輕度擴增（補充圖 3I）。然而，在 24 周時，各組骨髓中 LSK 細胞嵌合率未見明顯差異（補充圖 3J）。二次 BM 移植小鼠中也觀察到類似結果（補充圖 3K-M）。這些數據表明，MplW514L 并未賦予 HSC 競爭優勢。

鑒于接受總 MplW514L 表達骨髓移植的小鼠可出現可移植的血小板增多和 ET 表型，但在競爭性 BMT 背景下未觀察到這一現象，我們進一步判斷疾病起始是否需要特定劑量的突變 HSC。我們使用 50% 和 25% 突變細胞進行了競爭性移植中的突變 HSC 梯度實驗。與接受年輕 WT 骨髓的受體相比，接受 50% 年輕 MplW514L 表達骨髓的受體再現 ET 表型，并表現出顯著升高的血小板計數。相反，接受 25% 年輕 MplW514L 表達骨髓的受體循環血小板未升高（圖 3J）。有趣的是，與接受老齡野生型骨髓的受體相比，接受 50% 和 25% 老齡 MplW514L 表達骨髓的受體均發生 ET 表型，并表現出明顯血小板增多（圖 3K）。我們對這些嵌合小鼠監測長達 4 個月，觀察到外周血中 MplW514L 表達 BM 來源細胞比例保持穩定（補充圖 3N-O）。這些發現提示，MplW514L 驅動的疾病起始可能依賴突變 HSC 的數量閾值，并且老齡 MplW514L 表達 HSC 具有更強的致病潛能。

MplW514L 增強突變 HSC 內的巨核細胞譜系承諾

為解析 MplW514L 在造血干細胞和祖細胞中的功能特征，我們對來自年輕（2 月齡）和老齡（10 月齡）MplW514L 小鼠及其 WT 同窩對照的骨髓 lineage-negative（Lin-）細胞進行了單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）（圖 4A）。經質量控制、降維和聚類后，鑒定出 17 種不同細胞群，包括 HSC、CD201 高表達 HSC（CD201_HSC）、多能祖細胞（MPP）、巨核-紅系祖細胞（MEP）、巨核祖細胞（MkP）、紅系祖細胞（EryP1 和 EryP2）、淋巴系傾向性多能祖細胞（LMPP）、粒-單祖細胞（GMP）、粒細胞祖細胞（GP）、中性粒細胞前體（ProNeu）、共同單核細胞祖細胞（CMoPs）、早幼單核細胞（ProMono）、單核-樹突狀細胞祖細胞（MDP）、共同樹突狀細胞祖細胞（CDP）、共同淋巴祖細胞（CLP）和嗜堿/肥大細胞祖細胞（Baso/Mast）（補充圖 4A-B）。MplW514L 突變并未改變 Mpl 的整體表達譜；Mpl 主要在 HSC 和 MkP 中表達（補充圖 4C）。

我們鑒定出一個新的 CD201_HSC 細胞簇，該細胞簇在年輕 MplW514L 小鼠中顯著擴增，但在老齡 MplW514L 小鼠中減少（圖 4A-B）。該 CD201_HSC 亞群高表達 CD201（Procr）和 Mpl（圖 4C）。基因共表達分析顯示，CD201+ HSCs 呈現與 MkP 相關基因模塊相似的轉錄程序，提示其向巨核細胞分化預先啟動（圖 4D）。與經典 HSC 相比，CD201_HSCs 表現出更高的轉錄活性、應激反應特征，以及強烈的巨核細胞偏向性轉錄譜（圖 4E）。軌跡分析還顯示，CD201_HSCs 起源于 HSC，并沿一條不同于 MEP 的獨立譜系路徑分化（圖 4F）。此外，CD201_HSCs 的轉錄譜與既往報道的 HSC 高度相似，后者以 Vwf 和 Itga2b（CD41）水平升高為特征，并與快速產生巨核細胞/血小板的潛能相關（圖 4C）。綜上，我們的結果表明，MplW514L 突變導致一個獨特的 CD201_HSC 亞群擴增，并賦予 HSC 巨核細胞譜系偏向。

為確認該亞群的變化，我們對年輕 MplW514L 小鼠骨髓進行了流式細胞術分析（圖 5A）。我們發現，與 WT 同窩對照相比，MplW514L 小鼠 SLAM-LSK 中 CD201+ 細胞的比例和細胞數顯著升高（圖 5B）。MplW514L 小鼠中 CD41+ SLAM-LSK 和 Mpl+ SLAM-LSK 也分別出現類似擴增（圖 5C 和補充圖 4D）。為進一步探索 CD201+ HSCs 的生物學功能，我們從 MplW514L 小鼠及其 WT 同窩對照骨髓中分選 CD201+ HSCs（圖 5D），隨后將這些細胞用于體外液體培養和體內骨髓移植。在促巨核細胞分化條件下進行液體培養分析顯示，MplW514L 表達 CD201+ HSCs 生成的 CD41+ 細胞顯著多于 WT CD201+ HSCs（圖 5E）。移植后，接受 MplW514L 表達 CD201+ HSCs 的受體發生 ET 樣 MPN，表現為血小板計數升高（圖 5F）、骨髓中巨核細胞和 LSK 細胞增加（圖 5G-H），以及異常巨核細胞增生（圖 5I）。這些發現表明，MplW514L 突變驅動具有巨核細胞譜系偏向的 CD201+ HSC 亞群擴增，而該亞群足以在體內起始 MPN。

MplW514L 誘導共同髓系祖細胞區室發生巨核細胞偏斜

scRNA-seq 分析還顯示，MplW514L 小鼠的造血祖細胞發生顯著改變，包括 MEPs 和 GPs 增加，以及老齡 MplW514L 小鼠中紅系祖細胞（EryP）過度擴增（圖 4A-B）。隨后，我們通過流式細胞術分析 MplW514L 小鼠造血祖細胞的譜系區室。我們發現，與 WT 同窩對照相比，MplW514L 小鼠中免疫表型定義的髓系祖細胞（Lin-Sca-cKit+，LK）增加（圖 6A-B）。MPs 升高主要源于 MEP（Lin-Sca-cKit+CD16/32-CD34-）和 GMP（Lin-Sca-cKit+CD16/32-CD34+）顯著擴增，而非共同髓系祖細胞（Lin-Sca-cKit+CD16/32-CD34+，CMP）增加（圖 6A-B）。根據 CD105、CD150 和 CD41 的表達對 MPs 進行進一步分析發現，巨核-紅系前體祖細胞（Lin-Sca-cKit+CD41-CD16/32-CD150+CD105-，Pre Meg-E）的比例也在 MplW514L 小鼠中增加。值得注意的是，限制于巨核細胞命運的 MkPs（Lin-Sca-cKit+CD150+CD41+）在 MplW514L 小鼠中較 WT 同窩對照顯著擴增（圖 6C）。這些數據表明，MplW514L 突變增強了造血祖細胞的巨核細胞偏斜，使巨核-紅系祖細胞相對于粒-單祖細胞增加（圖 6D）。

單細胞轉錄組分析顯示，MplW514L 小鼠 MEP 中存在巨核細胞譜系偏向（圖 6E）。與這一改變的表達譜一致，CellOracle 分析顯示，在 MplW514L 表達 MEP 中，巨核細胞分化關鍵轉錄因子 Fli1 高表達（圖 6F）。在老齡 MplW514L 小鼠的 MEP 中，與紅系分化相關的多條信號通路顯著下調，包括核糖體合成、內吞作用以及紅細胞分化的直接調控（圖 6G）。

盡管紅細胞集落形成單位前體細胞（Lin-Sca-cKit+CD41-CD16/32-CD150+CD105+，Pre CFU-E）在 MplW514L 小鼠中較 WT 同窩對照顯著擴增（圖 6C），但紅系祖細胞的轉錄組分析顯示，老齡 MplW514L 小鼠的紅系祖細胞具有受損特征（補充圖 5A）。此外，差異表達基因富集分析和轉錄因子活性分析提示，這些小鼠的紅系祖細胞存在發育阻滯（補充圖 5B-C）。這些發現可能解釋了老齡 MplW514L 小鼠中紅系前體過度擴增但仍發展為貧血的現象。為進一步評估紅系分化，我們將從 MplW514L 小鼠及其 WT 對照中分選的 Pre CFU-E 細胞置于含促紅細胞生成素的培養基中培養。培養 1 天后，與 WT 對照組相比，MplW514L 組中的紅系祖細胞和前體細胞顯著減少（補充圖 5D-F）。

已有研究表明，MplW514L 突變導致 Mpl 信號激活，即使在不存在 TPO 的情況下，也對其配體 TPO 結合呈高敏感性。我們將來自 MplW514L 小鼠及其 WT 對照的 lineage-negative BM 細胞培養于含 TPO 的培養基中。正如預期，WT BM 細胞在無 TPO 條件下不增殖，而在 TPO 刺激下明顯擴增。令人矚目的是，MplW514L 表達 BM 細胞表現出不依賴 TPO 刺激的顯著巨核細胞擴增（圖 6H）。此外，與 MplW514L 小鼠年齡依賴性骨髓纖維化相一致，我們發現老齡 MplW514L 小鼠而非年輕小鼠的 MkPs 中促纖維化評分顯著升高（圖 6I）。

Fedratinib 緩解 MplW514L 小鼠的 MPN 特征，但不能清除疾病起始細胞

我們已證明，MplW514L 驅動的 MPN 起始細胞特別富集于 HSC 群體中，其中 MplW514L 突變導致賦予巨核細胞譜系偏向的 CD201_HSC 亞群擴增。為評估臨床用于 MPN 治療的 JAK2 抑制劑作用，我們首先檢測了 MplW514L HSC 中的 JAK2 信號。盡管與經典 HSC 相比，CD201_HSC 中 JAK-STAT 信號顯著富集，但 MplW514L 突變并未使 CD201_HSC 的 JAK-STAT 信號評分高于 WT CD201_HSC（補充圖 6A-B）。CD201+ HSCs 中 STAT5 磷酸化水平與 WT 對照相當，這進一步證實了上述結果（補充圖 6C）。這些發現提示，在該模型中，可能存在 JAK/STAT 非依賴性機制驅動疾病起始性 HSC 擴增。

為直接評估 JAK2 抑制劑對 MplW514L 小鼠的治療作用，我們給予 Fedratinib（一種 JAK2 抑制劑）治療，每日兩次、持續 4 周（60 mg/kg，灌胃）。Fedratinib 治療對 MplW514L 小鼠升高的血小板沒有影響（補充圖 6D），這可能與血小板半衰期較長以及治療持續時間有限有關。值得注意的是，流式細胞術分析顯示，Fedratinib 治療后升高的 CD41+ 細胞顯著減少，同時降低的 TER119+ 細胞明顯恢復（圖 7A-B）。骨髓組織病理學分析中也觀察到類似結果（圖 7C）。這些數據表明，Fedratinib 治療可減少骨髓中的巨核細胞增生。

然而，與溶劑對照相比，Fedratinib 治療小鼠骨髓中的 LSK 頻率未見明顯差異（圖 7D）。我們收集經治療 MplW514L 小鼠的骨髓細胞并進行 Western blot 分析。與 WT 同窩對照相比，MplW514L 小鼠骨髓細胞中 STAT5 和 STAT3 磷酸化呈組成性升高，而在 Fedratinib 治療小鼠中該升高顯著降低（圖 7E）。這些數據表明，Fedratinib 治療能夠有效抑制 JAK-STAT 信號。

我們的單細胞 RNA-seq 分析顯示，CD201 在 HSC 中高度且特異表達，因此可作為骨髓切片中原位識別 HSC 的穩健標志物。隨后，我們對這些小鼠骨髓切片進行 CD201 免疫組化染色（IHC），以評估 HSC。CD201 IHC 分析顯示，Fedratinib 治療后骨髓中 CD201+ 細胞頻率未發生變化，提示 JAK2 抑制劑不影響突變 HSC（圖 7F）。這與“JAK 抑制能夠緩解疾病表現，但不能根除 HSC 樣細胞群”的觀點一致。為進一步研究這種持續存在的功能后果，我們將 Fedratinib 治療 MplW514L 小鼠的骨髓移植入經致死劑量照射的野生型小鼠。無論接受 Fedratinib 處理或未處理 BM 的受體小鼠，在移植后長達 5 個月內均持續表現出血小板升高，提示 Fedratinib 對 MplW514L 小鼠中的疾病起始細胞沒有影響（圖 7G）。

圖 1 MplW514L 敲入小鼠表現出 ET 相關 MPN 表型。

（A）MplW514L 條件性敲入小鼠基因靶向策略示意圖。（B）使用尾 DNA 對 A 中小鼠進行 PCR 基因分型。（C）對指定基因型小鼠骨髓單個核細胞中 Mpl mRNA 水平進行定量 PCR 分析。數據來自三次不同實驗，并以均值 ± SD 表示。（D）使用 Mpl 引物對指定小鼠 BM cDNA 來源 PCR 產物測序所得的色譜圖。（E）根據補充圖 S1B-C 所示，通過擴增編碼 MplW514L 和 Mpl-WT 的混合質粒建立標準曲線，確定 MplW514L 突變等位基因（T）與 Mpl-WT 等位基因（G）的比例。數據以均值 ± SD 表示，每個點代表一只小鼠。（F）對指定基因型小鼠骨髓單個核細胞中指定蛋白進行免疫印跡分析。HSC70 作為上樣對照。數據代表兩次獨立實驗。（G-J）指定小鼠在 2–12 月齡時的外周血參數。數據以均值 ± SD 表示，每個點代表一只小鼠。P 值采用雙因素 ANOVA 并結合 Sidak 多重比較檢驗確定。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001，NS 表示差異無統計學意義。

圖 2 老齡 MplW514L 小鼠進展為骨髓纖維化。

（A）10 月齡指定小鼠股骨示意圖（左）和骨髓細胞統計分析（右）。數據以均值 ± SD 表示，每個點代表一只小鼠。（B）A 中小鼠體重統計分析。數據以均值 ± SD 表示，每個點代表一只小鼠。（C）A 中小鼠骨髓代表性組織病理學圖像，包括蘇木精-伊紅（H&E）染色（上）和網狀纖維染色（下）。黑色箭頭表示巨核細胞增生。比例尺：50 μm。（D-F）根據指定小鼠骨髓細胞流式細胞術分析，統計 CD41+（D）、TER119+（E）和 Mac1+Gr1+（F）細胞比例。代表性流式圖見圖 S2C。數據以均值 ± SD 表示，每個點代表一只小鼠。（G）A 中小鼠脾臟示意圖（左）和脾重統計分析（右）。每個點代表一只小鼠。數據以均值 ± SD 表示。（H）A 中小鼠指定細胞比例統計分析。數據以均值 ± SD 表示，每個點代表一只小鼠。（I）A 中小鼠脾臟代表性組織病理學圖像，包括 H&E 染色（上）和網狀纖維染色（下）。比例尺：50 μm。（J）老齡 MplW514L 小鼠（9–12 月齡）的纖維化評分。所示數據代表兩次獨立實驗。所有 P 值均采用單因素 ANOVA 并結合 Dunnett 多重比較檢驗確定。

圖 3 MplW514L 驅動的 MPN 起始細胞富集于含 HSC 的 LSK 群體。

（A）2 月齡指定小鼠骨髓中 LSK 和 SLAM-LSK 細胞的代表性流式細胞術分析。（B）A 中 LSK 和 SLAM-LSK 細胞的定量分析。P 值采用雙尾非配對 Student t 檢驗確定。（C）使用從 MplW514L 小鼠或 WT 同窩對照中分選的 LSK 和 LK 細胞進行骨髓移植的示意圖。將 4×10^4 個 LSK 或 4×10^5 個 LK 與 5×10^5 個支持性骨髓細胞共同移植入經致死劑量照射的 CD45.1 小鼠。（D）C 中小鼠外周血血小板參數。P 值采用雙因素 ANOVA 并結合 Sidak 多重比較檢驗確定。（E-F）C 中小鼠骨髓中 CD41+ 和 LSK 細胞定量分析。P 值采用單因素 ANOVA 并結合 Dunnett 多重比較檢驗確定。（G）C 中小鼠骨髓切片代表性 H&E 染色和網狀纖維染色。箭頭表示巨核細胞增生。比例尺：50 μm。（H）圖 S3H 所示首次競爭性移植后的血小板參數。P 值采用雙尾非配對 Student t 檢驗確定。（I）圖 S3H 所示首次競爭性骨髓移植后外周血中的供體嵌合率。每組 n = 5。（J-K）分別使用年輕（J，2 月齡）或老齡（K，10 月齡）小鼠的梯度突變 HSC 進行移植后的血小板參數。每組 n = 5–7 只小鼠。P 值采用雙因素 ANOVA 并結合 Sidak 多重比較檢驗確定。所有數據均以均值 ± SD 表示。在散點圖中，每個點代表一只小鼠。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001，NS 表示差異無統計學意義。

圖 4 MplW514L 突變增強造血干細胞中的巨核細胞譜系承諾。

（A）來自年輕（2 月齡）和老齡（10 月齡）MplW514L 小鼠及其 WT 同窩對照的 scRNA-seq 數據集中所有細胞的 UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）可視化（n = 19190 個細胞）。（B）堆疊柱狀圖顯示 A 中除 EryP1 和 EryP2 外各細胞簇的比例。紅色箭頭突出顯示年輕 MplW514L 小鼠相較年輕 WT 對照增加的細胞群。（C）基于 UMAP 的特征圖展示單細胞分辨率下所選基因的表達水平。（D）CD201_HSC 內基因兩兩 Spearman 相關性。熱圖顯示 MkP 相關基因模塊表達增加。（E）與經典 HSC 亞群相比，CD201_HSCs 中上調基因富集的通路。（F）采用 Monocle（v2 與 v3）分析 HSC、CD201_HSC、MEP 和 MkP 細胞的發育軌跡。基于 UMAP 的軌跡圖顯示指定細胞群的分化進程，其中較深顏色代表早期分化階段，較淺顏色代表晚期階段（左）。基于擬時序的降維圖中，箭頭表示推斷的細胞分化方向（右）。

圖 5 MplW514L 突變驅動 CD201+ HSCs 擴增以起始 MPN。

（A）2 月齡指定小鼠骨髓中 CD201+ SLAM-LSK 和 CD41+ SLAM-LSK 細胞的代表性流式細胞術分析。（B-C）A 中 CD201+ SLAM-LSK 和 CD41+ SLAM-LSK 細胞頻率及絕對細胞數的定量分析。（D）研究 CD201+ HSCs 生物學功能的示意圖。從 MplW514L 小鼠及其 WT 同窩對照骨髓中分選 CD201+ HSCs，隨后進行體外液體培養和體內骨髓移植。（E）將指定 CD201+ HSCs 在含 TPO 的培養基中培養 7 天，并通過流式細胞術檢測 CD41+ 細胞計數。數據來自三次不同實驗。（F）D 中小鼠外周血血小板參數。分選 2×10^3 個指定 CD201+ HSCs，并與 5×10^5 個骨髓細胞作為支持細胞共同注入經致死劑量照射的 CD45.1 小鼠。標注“供體細胞群體 > 受體基因型”表示供體細胞來源和受體背景。（G-H）D 中小鼠骨髓中 CD41+ 和 LSK 細胞統計分析。（I）D 中小鼠骨髓代表性 H&E 染色。箭頭表示巨核細胞增生。比例尺：50 μm。所有數據均以均值 ± SD 表示。在散點圖中，每個點代表一只小鼠。所有 P 值均采用雙尾非配對 Student t 檢驗確定。

圖 6 MplW514L 小鼠在髓系祖細胞區室中表現出巨核細胞偏斜。

（A）10 月齡指定小鼠骨髓中 LK、CMP、GMP、MEP、MKP、Pre Meg-E 和 Pre CFU-E 的代表性流式細胞術分析。（B-C）A 中指定細胞群比例的定量分析。數據以均值 ± SD 表示，每個點代表一只小鼠。所示數據代表兩次獨立實驗。P 值采用雙尾非配對 Student t 檢驗確定。（D）總結 A 中 MplW514L 突變對造血祖細胞區室影響的示意圖。黑色箭頭表示正常分化，紅色箭頭表示增強的巨核細胞偏向性譜系承諾。（E）來自 scRNA-seq 數據（圖 4A）的 MEP 中基因兩兩 Spearman 相關性，顯示 MplW514L 小鼠中偏向 MkP 相關模塊。（F）基于 CellOracle 對 E 中 MEP 細胞特征向量中心性的評估。使用 CellOracle 進行調控網絡分析，以評估四組 MEP 細胞中基因的特征向量中心性評分，反映各基因在推斷基因調控網絡中的相對影響力。（G）E 中 MEP 細胞差異表達基因的通路富集分析。（H）來自 MplW514L 小鼠及其 WT 同窩對照培養骨髓細胞中 CD41+ 細胞的統計分析。分離 lineage-negative 細胞，并在含或不含血小板生成素（TPO）的培養基中培養 3 天。數據來自三次獨立實驗，并以均值 ± SD 表示。P 值采用雙因素 ANOVA 并結合 Sidak 多重比較檢驗確定。（I）使用 Seurat 中 AddModuleScore 函數，根據圖 4A 的 scRNA-seq 數據集，對指定巨核祖細胞（MkP）進行促纖維化評估。所有基因集見補充表 S4。P 值采用單因素 ANOVA 并結合 Tukey 多重比較檢驗確定。**P < 0.01。

圖 7 Fedratinib 緩解 MplW514L 小鼠的 MPN 特征，但不能清除疾病起始細胞。

（A-B）經 4 周 Fedratinib 治療后，MplW514L 小鼠及其 WT 同窩對照骨髓中 CD41+ 和 TER119+ 細胞比例的定量分析。P 值采用單因素 ANOVA 并結合 Tukey 多重比較檢驗確定。（C）A 中小鼠骨髓代表性蘇木精-伊紅（H&E）染色。比例尺：50 μm。（D）A 中小鼠骨髓 Lineage-Sca+cKit+（LSK）細胞比例統計分析。P 值采用單因素 ANOVA 并結合 Tukey 多重比較檢驗確定。（E）Fedratinib 治療 MplW514L 小鼠骨髓單個核細胞中指定蛋白的免疫印跡分析，HSC70 作為上樣對照。（F）溶劑對照和 Fedratinib 治療 MplW514L 小鼠骨髓切片中 CD201 免疫組化染色的代表性圖像。比例尺：50 μm。（G）接受 A 中指定小鼠未分選骨髓細胞的二級受體小鼠外周血血小板參數。將總骨髓移植入經致死劑量照射的野生型小鼠。P 值采用雙因素 ANOVA 并結合 Sidak 多重比較檢驗確定。NS 表示差異無統計學意義。所有數據均以均值 ± SD 表示，每個點代表一只小鼠。

【Citation】:Zhang S, Liu J, Li Y, et al. Physiological MplW514L expression in hematopoietic stem cell causes an essential thrombocythemia and progressive myelofibrosis.J Clin Invest.Published online April 23,

【貢獻】★★★★★

綜上所述，我們報道了一個 MplW514L 敲入小鼠模型，該模型發生類似人類 ET 的 MPN。我們證明，表達 MplW514L 的 HSC 區室具有獨特的疾病起始能力，但相較于野生型 HSC 并不具有競爭優勢。我們發現，MplW514L 表達導致 HSC 池內偏向巨核細胞的干細胞顯著擴增，并向巨核細胞譜系偏斜。JAK2 抑制劑治療能夠緩解 MPN 表型，但不能清除疾病起始細胞群。這些發現闡明了 MPLW515L 突變在 HSC 中生理性表達的后果，并為評估 MPLW515L 陽性 MPN 的治療策略提供了有價值的模型。

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