Int J Biol Sci I 靶向CPT1A，誘導肝星狀細胞鐵死亡：茜草天然產物Rubimaillin破解肝纖維化新機制！(尹航/蔣云瑤/徐英-清華...

2026年1月22日，清華大學藥學院/膜生物學國家重點實驗室尹航、蔣云瑤團隊聯合上海中醫藥大學徐英團隊、上海中醫藥大學附屬曙光醫院等，在International Journal of Biological Sciences（中科院1區，IF=10.0）在線發表題為 “Rubimaillin ameliorates liver fibrosis by triggering the ferroptosis of activated hepatic stellate cells through targeting CPT1A” 的研究論文。該研究聚焦肝纖維化進展中活化肝星狀細胞（HSCs）鐵死亡不足與代謝重編程異常這一關鍵問題，首次系統揭示中藥茜草來源天然產物 Rubimaillin（Rub）可直接靶向 CPT1A，誘導活化 HSCs 發生鐵死亡，從而顯著改善肝損傷與肝纖維化，為肝纖維化治療提供了新的天然產物候選物和潛在分子靶點。

▼編者按:

肝纖維化是多種慢性肝病向肝硬化、肝衰竭甚至肝癌進展的共同病理基礎，其核心特征是細胞外基質異常沉積和肝臟結構破壞。目前臨床上針對肝纖維化仍缺乏獲批的特異性抗纖維化藥物，治療主要依賴病因控制，如抗病毒、戒酒、減重和改善代謝紊亂等。因此，尋找能夠直接干預纖維化進程的新靶點和新藥物具有重要意義。

肝星狀細胞是肝纖維化發生發展的關鍵效應細胞。正常情況下，HSCs處于靜息狀態，主要負責儲存維生素A；當肝臟長期受損時，HSCs被激活并轉化為肌成纖維細胞樣細胞，表現出增強的增殖、遷移、收縮和細胞外基質分泌能力。近年來研究表明，誘導活化HSCs發生鐵死亡，可以抑制其異常增殖和膠原沉積，被認為是抗肝纖維化的重要策略。與此同時，CPT1A作為脂肪酸氧化的限速酶，參與細胞能量代謝重編程，并與HSCs活化和鐵死亡抵抗密切相關，因此具有重要的治療靶點價值。

本研究中，作者首先在TGF-β1誘導的LX2和JS1細胞模型中發現，Rub可濃度依賴性抑制HSCs活化，降低α-SMA、Col1A1等纖維化標志物表達。隨后，在CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型中，Rub顯著降低血清ALT、AST水平，改善肝組織病理損傷，減少Masson和Sirius red染色所示的膠原沉積，并降低α-SMA、Col1A1、Col3A1和TGF-β1等纖維化相關指標，提示Rub具有明確的抗肝損傷和抗纖維化作用。

為進一步解析其機制，研究團隊通過RNA-seq發現Rub處理后谷胱甘肽代謝和鐵死亡通路顯著富集，提示鐵死亡可能是Rub抗肝纖維化的核心機制。后續實驗進一步證實，Rub可增強活化HSCs中ACSL4表達，降低GPX4水平，并引起GSH減少、GSSG升高、脂質過氧化、ROS和Fe2?積累，以及線粒體縮小、嵴減少等典型鐵死亡特征。值得注意的是，Rub主要誘導活化HSCs鐵死亡，而對肝細胞、巨噬細胞和肝竇內皮細胞的鐵死亡影響相對有限，體現出一定的細胞選擇性。

在靶點發現方面，作者利用PROTAC靶點捕獲技術篩選Rub的直接作用蛋白，并將CPT1A確定為關鍵候選靶點。進一步通過分子動力學模擬、CETSA、DARTS、BLI和位點突變實驗證實，Rub可直接結合CPT1A，并通過SER592、THR594和THR689等關鍵位點抑制CPT1A活性。CPT1A敲低或過表達均可削弱Rub誘導HSCs鐵死亡的作用，說明CPT1A是Rub發揮抗纖維化效應的關鍵靶點。

機制上，Rub通過靶向CPT1A調控c-Myc泛素化，進而影響NRF2/GPX4抗氧化系統和ACSL4/PL-PUFAs脂質過氧化通路，最終推動活化HSCs發生代謝重編程介導的鐵死亡。換言之，Rub并非單純抑制HSCs活化，而是通過“靶向CPT1A—重塑脂肪酸代謝—削弱抗氧化防御—增強脂質過氧化—誘導鐵死亡”這一連續機制，從源頭上限制纖維化效應細胞的病理功能。

綜上，該研究不僅闡明了Rubimaillin抗肝纖維化的藥效基礎，還揭示了其直接靶點CPT1A及其介導的鐵死亡調控機制。該發現拓展了天然產物干預肝纖維化的研究思路，也為“靶向活化HSCs鐵死亡”這一治療策略提供了新的實驗依據。未來，若能在HSCs特異性CPT1A敲除動物模型和更接近臨床病因的肝纖維化模型中進一步驗證，將有望推動Rub及CPT1A靶向策略向抗肝纖維化藥物開發邁進。

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【摘要】

肝纖維化是指由于慢性肝損傷導致細胞外基質蛋白在肝臟中過度積累。靶向誘導活化肝星狀細胞（hepatic stellate cells, HSCs）發生鐵死亡，被認為是治療肝纖維化的一種有前景的策略。Rubimaillin（Rub）是從傳統中藥茜草（Rubia cordifolia L.）中提取的一種萘醌類化合物，在多種疾病中表現出多樣的藥理活性。本研究旨在探討 Rub 的抗肝纖維化作用、直接蛋白靶點及其分子機制。

研究結果表明，在小鼠模型中，Rub 可通過觸發活化 HSCs 的鐵死亡，有效改善肝纖維化。隨后，研究者利用 PROTAC 技術、計算機分子動力學模擬、細胞熱轉移實驗（CETSA）、藥物親和反應靶標穩定性實驗（DARTS）、生物層干涉技術（BLI）以及位點突變實驗，證實 Rub 可直接結合肉堿棕櫚酰轉移酶 1A（CPT1A）的 SER592、THR594 和 THR689 位點，并抑制其活性。

進一步研究發現，在活化 HSCs 中抑制或缺失 CPT1A 可觸發由代謝重編程介導的鐵死亡。此外，CPT1A 缺失或過表達均可消除 Rub 誘導鐵死亡的作用。從機制上看，Rub 誘導活化 HSCs 鐵死亡與其靶向 CPT1A 所介導的代謝重編程有關。綜上，本研究闡明了 Rub 通過誘導活化 HSCs 鐵死亡改善肝纖維化的有益作用、直接蛋白靶點及分子機制。

關鍵詞：Rubimaillin；肝纖維化；肝星狀細胞（HSCs）；鐵死亡；肉堿棕櫚酰轉移酶 1A（CPT1A）。

01

研究背景及科學問題

肝纖維化是多種慢性肝病進展過程中的關鍵共同病理過程。當肝臟持續受到損傷，例如受到慢性病毒性肝炎（乙型肝炎和丙型肝炎）、酒精性肝病、代謝功能障礙相關脂肪性肝病（MAFLD）、自身免疫性肝病等致病因素刺激時，肝星狀細胞（HSCs）被激活，細胞外基質（ECM）成分的合成增加而降解減少。隨后，大量 ECM 在肝組織中異常沉積，逐漸破壞肝臟正常結構，并使肝臟質地變硬，從而形成肝纖維化。

隨著生活方式改變，酒精性肝病和 MAFLD 的發生率急劇上升，再加上慢性病毒性肝炎的持續影響，肝纖維化患病率逐年增加。然而，肝纖維化領域仍存在未被滿足的臨床需求，目前尚無獲批用于其治療的特異性化學藥物或生物制劑。現階段主要治療方式仍是病因治療，例如慢性病毒性肝炎患者接受抗病毒治療，酒精性肝病患者戒酒，MAFLD 患者控制體重并改善代謝紊亂。鑒于現有治療手段的局限性以及肝纖維化形勢日益嚴峻，亟需尋找新的治療靶點和候選藥物。

肝纖維化的發生并非由單一因素導致，而是多種細胞類型、信號通路和細胞外環境相互交織并協同作用的結果。普遍認為，HSCs 是肝纖維化中的主要效應細胞，其活化是肝纖維化發病機制中的核心事件。在正常肝臟中，HSCs 處于靜息狀態，主要功能是儲存維生素 A 并維持肝臟正常結構。然而，當肝臟遭受持續損傷時，多種刺激信號會破壞 HSCs 穩態，促使其轉化為肌成纖維細胞樣細胞。活化后的 HSCs 獲得了較強的增殖和遷移能力、收縮特性以及分泌細胞因子和 ECM 的能力。值得注意的是，HSCs 的增殖和遷移需要大量能量輸入，從而觸發細胞代謝重編程。

肉堿棕櫚酰轉移酶 1A（CPT1A）是一種位于線粒體外膜的酶，可通過將長鏈脂肪酸轉運至線粒體進行 β-氧化來構成脂肪酸氧化的限速步驟，并以 ATP 形式產生能量，在調控細胞能量代謝中發揮重要作用。此外，CPT1A 介導的脂肪酸氧化可通過核苷代謝促進鼻咽癌細胞增殖。已有研究證實，在肝纖維化小鼠模型和肝纖維化患者的 HSCs 中，CPT1A 表達顯著升高；升高的 CPT1A 可誘導 HSCs 活化，從而促進肝纖維化進展。相反，在 HSCs 中通過藥理或遺傳方式抑制 CPT1A，可通過抑制 HSCs 活化來緩解肝纖維化。因此，開發靶向 CPT1A 的化合物可能為肝纖維化治療開辟新的途徑。

鐵死亡作為一種新型程序性細胞死亡方式，近年來在肝纖維化研究領域受到廣泛關注。與傳統的細胞凋亡和壞死不同，鐵死亡主要依賴鐵過載和脂質過氧化物積累，進而破壞細胞膜結構并觸發細胞死亡。多項研究表明，在肝纖維化過程中，細胞內鐵代謝失衡、鐵離子攝取增加以及儲存和輸出減少，會導致 HSCs 鐵過載，并為鐵死亡發生提供條件。研究證實，誘導活化 HSCs 發生鐵死亡可顯著降低 HSCs 生長、抑制 ECM 積累，從而緩解肝纖維化。因此，誘導活化 HSCs 鐵死亡正成為一種新的、有前景的肝纖維化治療策略。

目前，CPT1A 被認為是鐵死亡抵抗的重要驅動因子，阻斷 CPT1A 可觸發鐵死亡。近期研究表明，靶向 CPT1A 介導的代謝重編程可通過兩種關鍵機制誘導鐵死亡：一是下調核因子 E2 相關因子 2（NRF2）/谷胱甘肽過氧化物酶 4（GPX4）抗氧化系統；二是增強長鏈酰基輔酶 A 合成酶 4（ACSL4）介導的磷脂多不飽和脂肪酸（PL-PUFAs）生成，而這兩者均受 c-Myc 泛素化調控。因此，考慮到 CPT1A 在活化 HSCs 以及鐵死亡中的作用，作者推測 CPT1A 也可能通過介導代謝重塑來誘導活化 HSCs 鐵死亡，從而緩解肝纖維化。簡言之，靶向 CPT1A 介導的活化 HSCs 鐵死亡具有成為肝纖維化治療策略的潛力。

目前，針對中藥成分和天然產物的靶標捕獲技術已有多種。親和力基礎靶標鑒定可通過小分子與蛋白之間的固有親和力捕獲靶標，操作簡便，但容易受到非特異性結合事件的干擾；活性基礎蛋白質組學分析（ABPP）通過活性探針實現對蛋白活性位點的特異性結合，適用于酶類靶標，但應用范圍受限；無標記靶標鑒定可避免標簽干擾并重現靶標的生理結合狀態，但存在靈敏度低、檢測成本高等固有不足。

與這些主要聚焦于“靶標識別與鑒定”的傳統靶標捕獲技術相比，PROTAC 靶標捕獲技術作為一種先進的靶標解析工具，可避免對天然產物進行化學修飾，并能在活細胞生理條件下進行原位靶標捕獲，從而克服傳統方法的局限。因此，該技術已越來越多地用于中藥成分和天然產物的靶標鑒定，為該研究領域提供了新的高效策略。PROTAC 作為近年來發展起來的強大內源性蛋白降解工具，其核心優勢不僅在于可特異性結合靶蛋白，還可通過泛素-蛋白酶體系統觸發靶蛋白泛素化及后續降解，從而進一步提高靶標鑒定的可靠性。

茜草（Rubia cordifolia L.）的根或根莖是一種傳統中藥，在中國被廣泛用于治療關節炎、子宮出血和慢性肝病。Rubimaillin（Rub，又稱 Mollugin）是從茜草中提取的一種萘醌類化合物，在研究中顯示出抗腫瘤、抗炎和神經保護等多種藥理活性。此外，有報道顯示 Rub 可抑制結直腸癌細胞增殖并驅動鐵死亡。然而，Rub 在肝纖維化中的作用仍未得到充分闡明。鑒于 CPT1A 在 HSCs 活化及其鐵死亡抵抗中發揮核心作用，同時考慮到 Rub 調控鐵死亡的潛力，本研究假設 Rub 可能通過靶向 HSCs 中的 CPT1A 并誘導其鐵死亡，從而發揮抗肝纖維化作用。

在本研究中，為評估 Rub 的抗肝纖維化作用，作者建立了轉化生長因子 β1（TGF-β1）誘導的 HSCs 活化模型和四氯化碳（CCl4）誘導的肝纖維化模型。隨后，研究者通過 RNA 測序（RNA-seq）分析探索潛在機制，并通過驗證實驗證實 Rub 可誘導活化 HSCs 鐵死亡。PROTAC、分子對接和結合實驗鑒定并驗證了 Rub 與 CPT1A 的相互作用。CPT1A 敲低和過表達模型進一步驗證了 Rub 誘導鐵死亡對 CPT1A 的依賴性。最后，研究者分析了 Rub 對 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路的調控，以闡明其通過靶向 CPT1A 誘導鐵死亡的機制。

02

重要發現及亮點

Rub 在體外抑制 HSCs 活化

為評價 Rub 在體外對 HSCs 活化的抑制作用，研究者采用 TGF-β1 誘導人 HSCs 細胞系 LX2 和小鼠 HSCs 細胞系 JS1 的活化。在評價 HSCs 活化之前，首先通過 CCK8 實驗檢測 Rub 對 LX2 和 JS1 細胞活力的影響。LX2 和 JS1 細胞在有或無 TGF-β1 誘導的條件下，同時接受不同濃度 Rub 處理 48 小時。如圖 1A 所示，在 25–300 μM 范圍內，Rub 對 LX2 和 JS1 細胞活力表現出不同程度的濃度依賴性抑制作用。顯然，Rub 對 TGF-β1 誘導細胞的活力抑制作用更為顯著。

進一步分析細胞活力抑制率發現，Rub 對 TGF-β1 刺激的 LX2 和 JS1 細胞抑制率超過 20%（范圍：20.94%–31.63%），而對未受 TGF-β1 刺激的 LX2 和 JS1 細胞抑制率低于 20%（范圍：2.70%–16.68%），且兩種細胞系中 TGF-β1 刺激組與未刺激組之間差異均具有統計學意義（圖 1B）。因此，在 50、100 和 150 μM 濃度下，Rub 不會改變靜息 HSCs 的細胞活力。

隨后，研究者在 50、100 和 150 μM 濃度下評價 Rub 對 HSCs 活化的抑制作用。LX2 和 JS1 細胞經 TGF-β1 誘導活化并與 Rub 共孵育后，采用 qPCR 和 Western blot 檢測 HSCs 活化標志物 α-SMA 和 Col1A1。結果顯示，Rub 可顯著降低 LX2 和 JS1 細胞中 α-SMA 與 Col1A1 的 mRNA 表達，以及 α-SMA 蛋白表達，并呈濃度依賴性抑制（圖 1C-D）。此外，研究者還通過免疫熒光檢測 α-SMA 和 Col1A1 的表達，結果顯示，在 TGF-β1 誘導的 LX2 和 JS1 細胞中，α-SMA 和 Col1A1 陽性染色熒光強度顯著增強；而不同濃度 Rub 孵育可明顯抑制該熒光增強（圖 1E-F）。綜上，這些結果證實 Rub 是一種潛在抑制劑，可顯著抑制 HSCs 活化。

圖 1. Rub對 LX2 和 JS1 細胞中 HSCs 活化的影響。（A）Rub 對 LX2 和 JS1 細胞活力的影響。（B）Rub 對 LX2 和 JS1 細胞活力的抑制率。（C）LX2 和 JS1 細胞中 α-SMA 和 Col1A1 的 mRNA 表達。（D）LX2 和 JS1 細胞中 α-SMA 的蛋白表達。（E）LX2 和 JS1 細胞中 α-SMA（綠色，比例尺 = 100 μm）和 Col1A1（紅色，比例尺 = 100 μm）的免疫熒光染色。（F）LX2 和 JS1 細胞中 α-SMA 和 Col1A1 陽性染色的熒光強度。所有實驗均進行 n = 3 次獨立生物學重復。 < 0.05 vs DMSO；*p < 0.05 vs TGF-β1。

Rub 有效改善 CCl4 誘導小鼠的肝損傷和肝纖維化

為考察 Rub 對肝損傷和肝纖維化的藥理作用，研究者通過每周 3 次腹腔注射 15% CCl4、持續 6 周建立小鼠肝纖維化模型，并從第 3 周開始給予 Rub（10 和 20 mg/kg）灌胃處理（圖 2A）。實驗結束后，依次評價小鼠肝損傷和肝纖維化指標。CCl4 組中升高的血清肝損傷標志物（如 AST 和 ALT 水平）經 Rub 處理后顯著降低（圖 2B）。

同時，肝組織病理學 H&E 染色結果如圖 2C 所示。與對照組相比，CCl4 誘導肝纖維化小鼠的肝組織出現明顯組織學改變，包括正常肝小葉結構被破壞、肝細胞腫脹并出現空泡樣變性、肝竇間隙變窄、纖維間隔增寬以及肝組織中明顯炎性細胞浸潤。然而，這些病理改變可被 Rub 處理顯著改善。

此外，研究者采用 Masson 染色和 Sirius red 染色評價膠原纖維沉積。在 CCl4 誘導的肝纖維化小鼠中，膠原沉積明顯，纖維間隔染色強烈，呈增厚和廣泛分布；同時，Masson 陽性面積和 Sirius red 陽性面積均顯著升高。Rub 處理后，纖維化小鼠膠原纖維沉積明顯減輕（圖 2D 和 F）。與此同時，作為膠原代謝重要指標的肝羥脯氨酸（Hyp）含量也被檢測，結果顯示 Rub 處理后 Hyp 含量明顯下降（圖 2G）。

HSCs 活化常用于評價體內肝纖維化的發生與發展。因此，本研究也像體外實驗一樣，通過 qPCR、Western blot 和免疫組織化學檢測 HSCs 活化相關指標。結果見圖 2E 和 H：免疫組織化學結果顯示，CCl4 組 α-SMA 陽性染色明顯增加，而 Rub 組顯著降低。qPCR 和 Western blot 結果顯示，CCl4 誘導小鼠肝組織中升高的 α-SMA 和 Col1A1 mRNA 表達，以及 α-SMA 蛋白表達，均被 Rub 處理顯著降低（圖 2I-J）。此外，CCl4 組中部分纖維化相關基因 Col1A3 和 TGF-β1 的 mRNA 表達也經 Rub 處理顯著降低（圖 2I）。這些結果提示，Rub 可抑制 CCl4 誘導小鼠中的 HSCs 活化。值得注意的是，在所有檢測參數中，Rub 的治療效果與陽性對照藥物索拉非尼（Sora）相當，甚至更優。總體而言，這些數據表明 Rub 可有效改善 CCl4 誘導小鼠的肝損傷和肝纖維化。

圖 2. Rub 對 CCl4 誘導小鼠肝損傷和肝纖維化的影響。（A）CCl4 注射并接受 Rub 或 Sora 治療小鼠的實驗流程示意圖。（B）血清 ALT 和 AST 活性。（C）H&E 染色（比例尺 = 100 μm 和 50 μm）。（D、F）Masson 和 Sirius red 染色（比例尺 = 100 μm）及其半定量分析。（E、H）α-SMA 免疫組織化學染色（黃褐色，比例尺 = 100 μm）及其半定量分析。（G）肝臟 Hyp 含量。（I）α-SMA、Col1A1、Col3A1 和 TGF-β1 的 mRNA 表達。（J）α-SMA 的蛋白表達。n = 6， < 0.05 vs Control；*p < 0.05 vs CCl4。

RNA-seq 分析顯示 Rub 調控鐵死亡通路

為探索 Rub 抗肝纖維化作用的分子機制，研究者對經 Rub 處理或未處理的纖維化肝組織進行 RNA-seq 分析。差異表達基因火山圖分析顯示，Rub-vs-CCl4 組的基因表達譜發生整體變化，共富集到 722 個下調基因和 1034 個上調基因（圖 3A）。在 KEGG 通路分析中，谷胱甘肽代謝和鐵死亡通路顯著富集（圖 3B）。

進一步采用基因集富集分析（GSEA）對這兩個通路進行分析，其 NES、P 值和 FDR 分別為：谷胱甘肽代謝（NES = -2.52，p < 0.001，FDR < 0.001）和鐵死亡（NES = -2.28，P < 0.001，FDR = 0.0）（圖 3C），提示這兩個通路在 GSEA 中同樣顯著富集。谷氨酸代謝參與鐵死亡并與該過程密切相關。鐵死亡通路差異表達基因熱圖如圖 3D 所示；例如，經 Rub 處理后，Hmox1、Slc7a11 和 Gclc 表達顯著降低，而 Acsl3、Acsl4 和 Acsl5 表達顯著升高。綜上，Rub 可在肝纖維化中顯著誘導鐵死亡，這可能是 Rub 抗肝纖維化作用的潛在分子機制。

圖 3. 基于 RNA-seq 分析的 Rub 對鐵死亡通路的影響。（A）火山圖顯示 mRNA 轉錄水平的 log2 倍數變化。（B）KEGG 通路富集分析（前 20 位）。（C）谷胱甘肽代謝和鐵死亡通路的 GSEA 分析。（D）基于 GSEA 分析的鐵死亡通路相關基因表達譜熱圖。

Rub 誘導活化 HSCs 發生鐵死亡

為確定 Rub 誘導鐵死亡發生于哪一類肝細胞，研究者評價了 Rub 對 HSCs、巨噬細胞、肝竇內皮細胞和肝細胞鐵死亡的影響。考慮到 HSCs 是介導肝纖維化的關鍵效應細胞，且越來越多證據表明誘導活化 HSCs 鐵死亡是治療肝纖維化的有效措施，研究者首先評價 Rub 是否可誘導活化 HSCs 鐵死亡。在本研究中，在 Rub 處理的 CCl4 誘導小鼠中觀察到活化 HSCs 的 Rub 誘導鐵死亡。具體而言，免疫熒光染色結果顯示，在 Rub 處理的纖維化小鼠中，鐵死亡過程正向調控因子 ACSL4 與活化 HSCs 標志物 α-SMA 的共染顯著上調（圖 4A 和 B）。

隨后，研究者開展一系列實驗，在體外評價 Rub 對活化 HSCs 鐵死亡的影響。首先，將 TGF-β1 誘導的 LX2 和 JS1 細胞與 Rub 及 Fer-1（一種鐵死亡抑制劑）共同孵育，結果顯示 Fer-1 可消除 Rub 對細胞活力的抑制作用（補充材料圖 S1A）。已有研究證實，在鐵死亡過程中，細胞線粒體的形態學變化表現為線粒體體積減小、雙層膜密度增加以及線粒體嵴減少或消失。結果如圖 4C 和補充材料圖 S1B 所示，在 Rub 處理的活化 LX2 和 JS1 細胞中觀察到與鐵死亡相關的線粒體形態改變。

與此同時，Rub 處理的活化 LX2 和 JS1 細胞中也出現了其他重要鐵死亡指標的變化，表現為 GSH 含量下降，GSSG、LPO、ROS 和 Fe2+ 水平升高（圖 4D-E 和補充材料圖 S1C-D）。此外，Rub 處理可顯著下調 GPX4 蛋白水平，并顯著上調 ACSL4 蛋白水平（補充材料圖 S1E）。研究者還評價了 Rub 對 HSCs 凋亡或壞死（兩種最常見的替代性細胞死亡方式）的影響，結果顯示 Rub 并未顯著調控 HSCs 的這兩類細胞死亡（補充材料圖 S2）。這些結果提示 Rub 可誘導 HSCs 發生鐵死亡。

根據鐵死亡關鍵指標 ACSL4 的免疫熒光結果可知，在肝纖維化中，Rub 主要調控纖維間隔間質細胞中這些蛋白的表達，提示 Rub 誘導的肝細胞鐵死亡主要發生于間質細胞。因此，研究者進一步評價 Rub 對巨噬細胞和肝竇內皮細胞鐵死亡的影響。結果顯示，Rub 處理組中 ACSL4 與 CD11b（肝 Kupffer 細胞標志物）和 CD34（肝竇內皮細胞標志物）的免疫熒光共染極少，與 CCl4 模型組相比無顯著差異（補充材料圖 S3A-B）。此外，研究者還在體外評價 Rub 對肝細胞鐵死亡的影響，結果顯示 Rub 不會促進肝細胞系 AML12 細胞發生鐵死亡（補充材料圖 S4）。綜上，上述結果證實，在肝纖維化中 Rub 可誘導活化 HSCs 發生鐵死亡。

圖 4. Rub 對活化 HSCs 鐵死亡的影響。（A）CCl4 誘導小鼠肝切片中 ACSL4（綠色）和 α-SMA（紅色）的免疫熒光共染（比例尺 = 100 μm）。（B）ACSL4 和 α-SMA 共染的半定量分析。（C）TGF-β1 誘導的 LX2 細胞線粒體超微結構變化（比例尺 = 200 nm）。（D、E）TGF-β1 誘導的 LX2 細胞中 LPO、ROS 和 Fe2+ 的熒光染色（比例尺 = 100 μm）。所有實驗均進行 n = 3 次獨立生物學重復。 < 0.05 vs Control；*p < 0.05 vs CCl4 或 TGF-β1。

CPT1A 是 Rub-PROTAC 的降解靶標

為研究 Rub 在抗肝纖維化中的靶點，研究者采用 PROTAC 靶標捕獲技術在 LX2 細胞中鑒定其靶標。首先，選擇 Rub 合成 PROTAC 分子。為合成 Rub 的 PROTAC，研究者選取活性最強的 Rub 核心骨架結構作為目標蛋白（POI）配體，并將 Rub 與連接至沙利度胺的 1-聚乙二醇（1-PEG）連接子偶聯，獲得 PROTAC 分子（稱為 Rub-PROTAC）（圖 5A 和補充材料方案 S1）。與此同時，Rub-PROTAC 對 TGF-β1 刺激 LX2 細胞中 α-SMA 蛋白表達也表現出顯著抑制活性（圖 5B）。

為研究直接而非間接蛋白降解，LX2 細胞僅用 Rub-PROTAC 和 DMSO 處理 10 小時；隨后采用 4D-DIA 蛋白質組學分析 Rub-PROTAC 顯著降解的蛋白（圖 5C）。如圖 5D 和 E 所示，一些蛋白顯著下調，如 ZC3H11A、CPT1A、PDCD11、ABCF3 和 COPB2。在這些蛋白中，已有研究報道 CPT1A 對肝纖維化發展和鐵死亡過程至關重要。在肝纖維化中，CPT1A 缺失可緩解 HSCs 活化和肝纖維化。此外，已有研究表明 CPT1A 缺乏可誘導肺癌細胞發生鐵死亡。結合分析結果與 Rub 的藥理作用，研究者最終將研究重點集中于 CPT1A。

為驗證蛋白質組學分析結果，研究者將 LX2 和 JS1 細胞與不同濃度 Rub-PROTAC 共孵育 10 小時。結果顯示，Rub-PROTAC 以濃度依賴性方式增強 CPT1A 泛素化（Ub-CPT1A），并以濃度依賴性方式降解 CPT1A 蛋白（圖 5F）。隨后，研究者將經 Rub-PROTAC 處理的細胞與泛素化抑制劑 MG132 共孵育，結果顯示 MG132 可消除 Rub-PROTAC 介導的 Ub-CPT1A 增強和 CPT1A 蛋白降解（圖 5G）。進一步地，研究者在 LX2 和 JS1 細胞中同時共孵育 Rub 和 Rub-PROTAC，以評價是否存在對 CPT1A 的競爭性結合。結果顯示，Rub 可部分逆轉 Rub-PROTAC 對 CPT1A 蛋白的降解作用（圖 5H）。總之，上述結果證實 Rub-PROTAC 通過泛素化通路降解 CPT1A 蛋白，且 CPT1A 可能是 Rub 的結合靶標。

圖 5. 利用 PROTAC 技術在 LX2 細胞中分析并確定 Rub 靶蛋白。（A）Rub 探針與 PROTAC 分子（Rub-PROTAC）的合成。（B）Rub 和 Rub-PROTAC 處理 LX2 細胞后 α-SMA 的蛋白表達。（C）基于 4D-DIA 蛋白質組學分析的靶標鑒定流程。（D）差異蛋白火山圖。（E）log2FoldChange < -1 的降解蛋白。（F）Rub-PROTAC 處理 LX2 和 JS1 細胞中 CPT1A 蛋白的濃度依賴性泛素化與降解。（G）MG132 和 Rub-PROTAC 處理 LX2 和 JS1 細胞中 CPT1A 蛋白的泛素化與降解。（H）Rub-PROTAC 與 Rub 共處理 LX2 和 JS1 細胞 10 小時后 CPT1A 的蛋白水平。所有實驗均進行 n = 3 次獨立生物學重復。 < 0.05 vs DMSO；*p < 0.05 vs TGF-β1 或 Rub-PROTAC。

Rub 在 HSCs 中直接靶向 CPT1A

為確認 CPT1A 是 Rub 的直接靶點，研究者首先選擇 CPT1A-Rub 復合物和 CPT1A 進行分子動力學模擬，以評價 Rub 與 CPT1A 的結合。在整個模擬過程中（200 ns），CPT1A 的 Cα 主鏈均方根偏差（RMSD）基本穩定在 3 ?，說明該系統在模擬過程中達到平衡狀態。CPT1A-Rub 復合物的 Cα 主鏈 RMSD 從模擬初期升至 6 ?，隨后在模擬中期降至 5 ?，并在模擬后期穩定維持在 5 ? 以下，提示該結合構象具有較高熱力學穩定性（圖 6A）。

從均方根波動（RMSF）結果可見，CPT1A 活性位點氨基酸殘基的 RMSF 基本低于 2.0–2.5 ?，提示 CPT1A-Rub 的配體結合可穩定活性位點的局部構象（圖 6B）。同時，研究者還監測了 CPT1A-Rub 系統中的氫鍵數量、旋轉半徑（Rg）和溶劑可及表面積（SASA）變化（圖 6C-E）。這些結果進一步表明，Rub 在整個模擬過程中可穩定結合 CPT1A；CPT1A-Rub 的氫鍵數量保持穩定，且氫鍵結合位點也一致。此外，自由能景觀（FEL）分析顯示，PC1(20)/PC2(-20) 是一個低能量凹陷，提示此時 Rub 和 CPT1A 的構象穩定（圖 6F）。這些數據表明 Rub 可在整個模擬過程中穩定結合 CPT1A。

隨后，研究者分別采用細胞熱轉移實驗（CETSA）、藥物親和反應靶標穩定性（DARTS）實驗和生物層干涉（BLI）實驗評價 Rub 與 CPT1A 的結合能力。在 CETSA 實驗中，Rub 明顯提高 LX2 和 JS1 細胞中 CPT1A 蛋白的細胞熱穩定性（圖 6G）。在 DARTS 實驗中，Rub 孵育后 LX2 和 JS1 細胞中 CPT1A 的降解顯著減少（圖 6H）。在 BLI 實驗中，Rub 與 CPT1A 的平衡解離常數（KD）為 3.77E-04 mol/L（圖 6I）。此外，研究者評價了 Rub 對 CPT1A 活性的影響，發現 Rub 可顯著抑制 LX2 和 JS1 細胞中的 CPT1A 活性（圖 6J 和補充材料圖 S5A）。

進一步地，研究者進行分子對接模擬以研究 Rub-CPT1A 復合物的結合模式。結果顯示，Rub 可能與 CPT1A 的 SER592、THR594 和 THR689 形成氫鍵網絡（圖 6K）。最后，在 shRNA 介導內源性 CPT1A 敲低的 LX2 細胞中，將 SER592、THR594 和 THR689 系統性突變為丙氨酸，并隨后過表達野生型 CPT1A。結果發現，這些位點突變顯著削弱了 Rub 對 CPT1A 活性的抑制作用，提示 SER592、THR594 和 THR689 是 Rub 抑制 CPT1A 活性的關鍵結合位點（圖 6L）。

為評價 Rub 相較其他肝細胞類型對 HSCs 的特異性，研究者在 150 μM 濃度下檢測 Rub 對 TGF-β1 活化 LX2 細胞、正常小鼠肝細胞（AML12）、LPS 極化小鼠骨髓來源巨噬細胞（iBMDM）以及 VEGF 刺激的人肝竇內皮細胞（HHSEC）中 CPT1A 活性的影響，并比較不同細胞間的活性抑制率。結果顯示，Rub 在 LX2 細胞中對 CPT1A 活性的抑制效率顯著高于 AML12、iBMDM 和 HHSEC 細胞（補充材料圖 S5B-C）。同時，研究者檢測了 Rub 處理后肝組織中 CPT1A 的表達，結果顯示 Rub 可顯著降低 CCl4 誘導肝纖維化中的 CPT1A 蛋白水平（補充圖 S5D）。綜上，這些結果提示 CPT1A 是 Rub 在 HSCs 中的直接藥理靶點。

圖 6. Rub 直接靶向 CPT1A 的驗證。（A）采用均方根偏差（RMSD）評價 Rub-CPT1A 結合穩定性。（B）均方根波動（RMSF）。（C）模擬過程中的氫鍵數量。（D）旋轉半徑（Rg）。（E）溶劑可及表面積（SASA）。（F）自由能景觀（FEL）分析。（G、H）采用 CETSA 和 DARTS 實驗檢測 LX2 和 JS1 細胞中 CPT1A 的蛋白水平。（I）BLI 實驗中 Rub 與 CPT1A 的結合動力學。（J）Rub 對 LX2 細胞中 CPT1A 活性的影響。（K）Rub 與 CPT1A 之間的分子對接模擬。（L）位點突變 LX2 細胞中 Rub 對 CPT1A 活性的影響。所有實驗均進行 n = 3 次獨立生物學重復。 < 0.05 vs Ctr 或 DMSO；*p < 0.05 vs TGF-β1 或 Rub-PROTAC。

Rub 通過靶向 CPT1A 誘導活化 LX2 細胞發生鐵死亡

基于此前關于 CPT1A 缺失可在肝纖維化過程中緩解 HSCs 活化，并可在腫瘤細胞中誘導鐵死亡的報道，研究者推測 CPT1A 同樣在誘導活化 HSCs 鐵死亡中發揮作用。為驗證這一假設，研究者進行了 CPT1A 活性抑制劑 Etomoxir 處理和 CPT1A 敲低實驗，以探討 CPT1A 在 TGF-β1 誘導 LX2 細胞中誘導鐵死亡的作用。首先，LX2 細胞用不同濃度 Etomoxir 培養 48 小時；結果顯示，在無 TGF-β1 刺激的 LX2 細胞中，Etomoxir 對細胞活力無抑制作用，但在 50 和 100 μM 濃度下對 TGF-β1 刺激的 LX2 細胞活力具有顯著抑制作用，尤其在 100 μM 時，細胞活力低于 80%（補充圖 S6A）。然而，Fer-1 可消除 Etomoxir 介導的 LX2 細胞生長抑制（補充圖 S6B）。

隨后，研究者觀察到明顯的鐵死亡線粒體形態學改變；在 TGF-β1 刺激的 Etomoxir 處理 LX2 細胞中，NADPH 和 GSH 含量顯著下降，GSSG、LPO、ROS 和 Fe2+ 水平顯著升高（補充圖 S6C-E）。此外，在 TGF-β1 誘導的 Etomoxir 處理 LX2 細胞中，ACSL4 蛋白表達顯著升高，而 GPX4 蛋白表達顯著降低（補充圖 S6F）。如預期，在 TGF-β1 誘導的 LX2 細胞中，CPT1A 敲低結果與 Etomoxir 處理結果一致（補充圖 S6C-F）。

此外，磷脂是構成細胞膜脂質雙層的基本成分，可根據其頭基分為磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰絲氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酸（PA）。PL-PUFAs 是脂質過氧化的主要底物，由 ACSL4 生成，被認為是鐵死亡的驅動因素。因此，研究者進行了非靶向脂質組學以分析 PL-PUFAs 的代謝狀態。結果顯示，在轉染 shCPT1A 的 LX2 細胞中，PL-PUFAs 水平升高，尤其是 PC-PUFAs、PE-PUFAs 和 PI-PUFAs（補充圖 S6G）。總之，這些數據提示阻斷 CPT1A 可誘導由代謝重編程介導的活化 HSCs 鐵死亡。

為驗證 Rub 誘導活化 HSCs 鐵死亡是否由靶向 CPT1A 介導，研究者進行 CPT1A 敲低實驗，以探索 CPT1A 在 TGF-β1 誘導 LX2 細胞中 Rub 誘導鐵死亡中的作用。如圖 7A-E 所示，在 TGF-β1 刺激的 LX2 細胞中，Rub 可明顯誘導鐵死亡線粒體形態變化，顯著降低 NADPH 和 GSH 含量，升高 GSSG、LPO、ROS、Fe2+ 和 PL-PUFAs 水平，同時增加 ACSL4 蛋白表達并抑制 GPX4 蛋白水平。隨后，研究者將靶向 CPT1A 的 shRNA 轉染入 TGF-β1 誘導的 LX2 細胞，再進行 Rub 孵育。結果顯示，加入 shCPT1A 后，Rub 誘導鐵死亡的顯著變化被明顯消除（圖 7A-F）。換言之，Rub 未能進一步加重 shCPT1A 轉染 LX2 細胞中的鐵死亡。

此外，研究者還評價了 CPT1A 過表達對 Rub 誘導鐵死亡的影響。與 CPT1A 敲低結果類似，CPT1A 過表達同樣消除了 Rub 在 LX2 細胞中誘導鐵死亡的作用（補充材料圖 S7A-D）。這些數據表明，CPT1A 敲低和 CPT1A 過表達均可消除 Rub 誘導 HSCs 鐵死亡的作用。綜上，這些結果證明 Rub 的鐵死亡誘導效應依賴于 CPT1A 介導的代謝重編程。

圖 7. CPT1A 缺失對 Rub 誘導 TGF-β1 誘導 LX2 細胞鐵死亡的影響。（A）LX2 細胞中 NADPH、GSH 和 GSSG 水平。（B、C）LX2 細胞線粒體超微結構變化（比例尺 = 200 μm）、LPO、ROS 和 Fe2+ 的熒光染色（比例尺 = 100 μm）。（D）LX2 細胞中 GPX4 和 ACSL4 的蛋白表達。（E、F）LX2 細胞中 PL-PUFAs 水平變化。所有實驗均進行 n = 3 次獨立生物學重復。*p < 0.05 vs shNC。

Rub 通過靶向 CPT1A 調控 c-Myc 泛素化介導的 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路

接下來，研究者繼續探索 Rub 如何通過 CPT1A 在 HSCs 中誘導鐵死亡。已有報道顯示，靶向 CPT1A 可通過抑制 c-Myc 泛素化，調控 NRF2/GPX4 抗氧化系統和 ACSL4/PL-PUFAs 通路，從而介導代謝重塑并誘導肺癌干細胞鐵死亡。結合本研究上述結果，作者假設 Rub 誘導鐵死亡與活化 HSCs 中 CPT1A 泛素化介導的 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路密切相關。因此，研究者評價了 Rub 對這些通路的影響。

Western blot 結果顯示，Rub 處理的 TGF-β1 誘導 LX2 細胞中 GPX4 和核 NRF2 蛋白水平降低，而 c-Myc 泛素化（Ub-c-Myc）、胞質 NRF2 和 ACSL4 蛋白水平升高（圖 8A），并伴隨 PL-PUFAs 水平升高（圖 7E）。隨后，研究者將靶向 CPT1A 的 shRNA 轉染入 TGF-β1 誘導的 LX2 細胞，以進一步研究 CPT1A 在 Rub 調控 c-Myc 泛素化以及 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路中的作用。Western blot 結果顯示，靶向 CPT1A 的 shRNA 顯著消除了 Rub 在 TGF-β1 誘導 LX2 細胞中調控 c-Myc 泛素化以及 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路的能力（圖 7E、圖 8C 和 D）。總之，研究結果證實，Rub 可通過促進 CPT1A 介導的 c-Myc 泛素化，并調控 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路，在活化 HSCs 中誘導由代謝重編程介導的鐵死亡（圖 9）。

圖 8. Rub 對 LX2 細胞中 c-Myc 泛素化介導的 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路的影響。（A、B）Rub 和 Etomoxir 對 LX2 細胞中 GPX4、ACSL4、核 NRF2、胞質 NRF2、c-Myc 泛素化和 c-Myc 蛋白水平的影響。（C、D）Rub 對 LX2 細胞中 GPX4、ACSL4、核 NRF2、胞質 NRF2、Ub-c-Myc 和 c-Myc 蛋白水平的影響。所有實驗均進行 n = 3 次獨立生物學重復。*p < 0.05 vs DMSO 或 shNC。

圖 9. Rub 通過靶向 CPT1A，在活化 HSCs 中誘導代謝重編程介導的鐵死亡，從而改善肝纖維化。在肝纖維化過程中，活化 HSCs 中 CPT1A 升高，可通過增強 NRF2/GPX4 通路介導的抗氧化能力，并抑制 ACSL4 介導的 PL-PUFAs 生成，阻止活化 HSCs 發生鐵死亡。經 Rub 處理后，Rub 可通過靶向 CPT1A，在活化 HSCs 中誘導由代謝重編程介導的鐵死亡，從而改善肝纖維化；這一過程與 c-Myc 泛素化介導的 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路調控密切相關。

【Citation】:Zhang, D., Tang, Q., He, X., Wen, C., Zhou, F., Wei, X., Wang, Z., Wang, J., Liu, W., Xu, Y., Jiang, Y., & Yin, H. (2026). Rubimaillin ameliorates liver fibrosis by triggering the ferroptosis of activated hepatic stellate cells through targeting CPT1A.International journal of biological sciences, 22(4), 2065–2084.

【貢獻】★★★★★

綜上，在本研究中，作者討論并證明 Rub 可在體內和體外通過誘導代謝重編程介導的活化 HSCs 鐵死亡，從而有效改善肝纖維化。研究者利用 PROTAC 靶標捕獲技術鑒定 CPT1A 為 Rub 的靶點，并通過計算機分子動力學模擬、CETSA、DARTS、BLI 和位點突變實驗驗證 Rub 可直接結合 CPT1A。

此外，研究者不僅證明 CPT1A 是誘導活化 HSCs 鐵死亡的重要調控因子，也證實其是 Rub 誘導鐵死亡的關鍵靶點。進一步結果顯示，Rub 通過靶向 CPT1A 在活化 HSCs 中誘導代謝重編程介導的鐵死亡，這可能與 c-Myc 泛素化介導的 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路有關。然而，本研究也存在一定局限性，尤其是關于 Rub 通過 CPT1A 介導對 HSCs 的特異性靶向驗證，仍需要利用體內 HSCs 特異性 CPT1A 敲除模型進一步確認。

總之，Rub 可通過靶向 CPT1A 誘導代謝重編程介導的活化 HSCs 鐵死亡，從而改善肝纖維化，為肝纖維化治療提供了一種有前景的策略。

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