Phytomedicine｜瞄準COPD鐵死亡與炎癥損傷：清肺通絡(luò)方抑制PTGS2/EPHX2，重塑花生四烯酸代謝?。▌⒂犁?靳曉杰/張志明—甘肅中醫(yī)藥大學）

2026年5月16日，甘肅中醫(yī)藥大學劉永琦團隊、靳曉杰團隊、張志明團隊等，聯(lián)合蘇州大學、甘肅省中醫(yī)院等單位，在Phytomedicine（JIF 顯示為 8.3，JCR Q1）在線發(fā)表題為 “Qingfei Tongluo Formula attenuates COPD-associated ferroptosis by restoring arachidonic acid metabolic balance via dual inhibition of prostaglandin-endoperoxide synthase 2 and soluble epoxide hydrolase 2” 的研究論文。該文于 2026年1月21日投稿，2026年5月9日修回，2026年5月13日接收，2026年5月16日在線發(fā)表。

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是全球重要慢性呼吸系統(tǒng)疾病之一，現(xiàn)有治療主要以支氣管擴張劑、吸入糖皮質(zhì)激素等對癥干預為主，仍難以阻止疾病進展或逆轉(zhuǎn)肺組織損傷。炎癥反應、氧化應激和鐵死亡被認為是COPD持續(xù)進展中的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)，而花生四烯酸（AA）代謝失衡可進一步放大脂質(zhì)過氧化、炎癥損傷和鐵死亡。該研究聚焦中藥復方清肺通絡(luò)方（QFTLF），試圖回答其改善COPD的核心分子機制及關(guān)鍵入血活性成分。

研究團隊構(gòu)建了COPD大鼠模型，并結(jié)合UPLC-MS/MS血清藥物化學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學、PS-V2N復雜網(wǎng)絡(luò)分析、單細胞RNA測序、計算機輔助藥物設(shè)計（CADD）、分子動力學模擬、SPR驗證以及體內(nèi)外實驗，系統(tǒng)解析清肺通絡(luò)方的多靶點作用機制。結(jié)果顯示，清肺通絡(luò)方可顯著改善COPD大鼠肺功能、肺組織病理損傷和系統(tǒng)性炎癥，其藥效與經(jīng)典治療藥物氨茶堿相當；同時，UPLC-MS/MS共鑒定出58個原型入血成分。

機制上，清肺通絡(luò)方能夠下調(diào)前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2/COX-2）和可溶性環(huán)氧化物水解酶2（EPHX2/sEH），并上調(diào)CYP2J2，從而恢復花生四烯酸代謝平衡。具體表現(xiàn)為抗炎、抗氧化代謝物11,12-EET升高，而促炎、促氧化代謝物11,12-DHET下降。隨之，TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子降低，MDA、Fe2?積累、HMGB1釋放和GPX4下調(diào)等脂質(zhì)過氧化及鐵死亡相關(guān)指標得到改善。

進一步的單細胞與組織驗證提示，PTGS2和EPHX2主要在ProSPC陽性的Ⅱ型肺泡上皮細胞（AT2 cells）中表達升高，而清肺通絡(luò)方干預后這一變化明顯減弱，說明AT2細胞可能是清肺通絡(luò)方調(diào)控COPD相關(guān)鐵死亡和炎癥損傷的重要細胞群。研究還發(fā)現(xiàn)，PTGS2和EPHX2特異性抑制劑在CSE誘導的MLE-12細胞損傷模型中呈現(xiàn)出與清肺通絡(luò)方相似的保護作用，進一步支持PTGS2/EPHX2雙靶點調(diào)控在該機制中的關(guān)鍵地位。

在活性物質(zhì)基礎(chǔ)方面，研究通過CADD和SPR驗證篩選出7個與靶點具有較高結(jié)合親和力的關(guān)鍵入血成分。其中，牡丹苷C、黃芩苷、牡荊素、蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷與PTGS2結(jié)合較強；金縷梅鞣質(zhì)、Choerospondin、牡荊素、Nepitrin、蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷與EPHX2結(jié)合較強。尤其是牡荊素和蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷顯示出作為PTGS2/EPHX2雙靶點候選成分的潛力。

總體來看，該研究提出清肺通絡(luò)方可能是一類天然來源的PTGS2/EPHX2雙重抑制干預方案，通過重塑花生四烯酸代謝平衡，減輕COPD肺上皮細胞相關(guān)鐵死亡、炎癥反應和脂質(zhì)過氧化，為中藥復方干預COPD進展提供了多組學和實驗驗證依據(jù)。但需要注意的是，研究證據(jù)主要來自動物模型、細胞模型和計算/結(jié)合實驗，不能直接等同于人體臨床療效。

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【摘要】

背景：慢性阻塞性肺疾?。–OPD）仍是全球重要健康挑戰(zhàn)，主要原因在于目前缺乏能夠改變疾病進展的治療手段。清肺通絡(luò)方（QFTLF）是一種經(jīng)典中藥復方，已在COPD中顯示出一定療效，但其具體分子機制和活性成分尚不明確。

目的：本研究旨在解析清肺通絡(luò)方抗COPD的多靶點作用機制，并系統(tǒng)鑒定其關(guān)鍵入血活性成分。

方法：研究首先在COPD大鼠模型中進行藥效學評價，并基于UPLC-MS/MS鑒定清肺通絡(luò)方原型入血成分。在此基礎(chǔ)上，研究整合轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學、基于PS-V2N的復雜網(wǎng)絡(luò)分析和單細胞RNA測序，識別原型入血成分調(diào)控的核心靶點、通路和細胞類型。關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)進一步通過體內(nèi)和體外實驗驗證。為鑒定關(guān)鍵入血活性成分，研究采用計算機輔助藥物設(shè)計（CADD）流程，包括誘導契合分子對接、分子動力學模擬和結(jié)合自由能計算，并通過表面等離子體共振（SPR）進行實驗確認。

結(jié)果：藥效學評價顯示，清肺通絡(luò)方顯著改善COPD大鼠肺功能、肺組織病理改變和系統(tǒng)性炎癥，其療效與經(jīng)典治療藥物氨茶堿相當。UPLC-MS/MS共鑒定出58個原型入血成分。多模態(tài)分析及實驗驗證表明，清肺通絡(luò)方在COPD大鼠肺組織和CSE誘導的MLE-12細胞中均可下調(diào)前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）和可溶性環(huán)氧化物水解酶2（EPHX2），同時上調(diào)CYP2J2。該調(diào)控作用恢復了花生四烯酸代謝平衡，使抗炎、抗氧化代謝物11,12-EET升高，促炎、促氧化代謝物11,12-DHET下降。由此，清肺通絡(luò)方抑制了下游病理指標，包括促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平，脂質(zhì)過氧化指標GSH和T-SOD降低、MDA升高，以及鐵死亡指標Fe2?積累、HMGB1釋放和GPX4下調(diào)。該作用與抑制PTGS2–PPARγ–CYP2J2通路和EPHX2介導通路有關(guān)。值得注意的是，PTGS2和EPHX2特異性抑制劑在CSE誘導的MLE-12細胞中的保護效應與清肺通絡(luò)方高度相似，進一步支持這些靶點參與其中。此外，CADD和SPR鑒定并驗證了7個具有較高結(jié)合親和力的關(guān)鍵入血成分：其中4個靶向PTGS2，包括Mudanpioside C、Baicalin、Vitexin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside；5個靶向EPHX2，包括Hamamelitannin、Choerospondin、Vitexin、Nepitrin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside。

結(jié)論：本研究表明，清肺通絡(luò)方是一種天然來源的PTGS2/EPHX2雙重抑制劑，可通過恢復花生四烯酸代謝平衡，減輕肺上皮細胞這一COPD主要損傷部位的COPD相關(guān)鐵死亡。研究將清肺通絡(luò)方及其關(guān)鍵成分定位為具有疾病修飾潛力的候選干預方案，為COPD治療中尚未滿足的臨床需求提供了新的研究依據(jù)。

01

研究背景及科學問題

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種進行性肺部疾病，主要特征是持續(xù)性氣流受限和呼吸道癥狀。全球范圍內(nèi)，COPD相關(guān)致殘率和死亡率仍在上升；隨著人口老齡化，其患病率預計還將進一步增加，公共衛(wèi)生負擔也會持續(xù)加重。COPD的主要病因是長期暴露于有害氣體和顆粒物，尤其是香煙煙霧（CS）。香煙煙霧可驅(qū)動持續(xù)炎癥、肺泡損傷，即肺氣腫，以及小氣道阻塞性改變，如黏液栓形成，最終導致不可逆氣流受限、氣道阻力升高和肺功能受損。極端溫度、聚氯乙烯產(chǎn)品釋放的鄰苯二甲酸酯等環(huán)境因素，也被認為會加重癥狀并推動疾病進展。COPD病因復雜，臨床異質(zhì)性明顯，使廣泛有效治療方案的開發(fā)面臨挑戰(zhàn)。目前臨床管理主要依賴長效支氣管擴張劑（LABAs/LAMAs）和吸入性糖皮質(zhì)激素（ICSs），這些治療可緩解癥狀，但難以阻止疾病進展或逆轉(zhuǎn)基礎(chǔ)組織損傷。因此，亟需開發(fā)能夠靶向COPD核心分子機制的新型治療策略。

在COPD的關(guān)鍵驅(qū)動因素中，慢性炎癥和氧化應激被認為是核心病理機制。長期暴露于香煙煙霧或其他環(huán)境污染物會破壞細胞穩(wěn)態(tài)，引起細胞功能障礙，并促進C反應蛋白、TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎介質(zhì)釋放，從而造成嚴重氣道損傷。這一炎癥級聯(lián)反應會同時誘發(fā)持續(xù)性氧化應激，形成活性氧積累和抗氧化能力耗竭的惡性循環(huán)。持續(xù)炎癥和過量ROS還會損害線粒體功能，導致線粒體ROS過度產(chǎn)生、線粒體DNA損傷和突變。這不僅放大氧化應激，還會擾亂線粒體自噬和線粒體動力學，最終削弱線粒體質(zhì)量控制，影響受損線粒體清除。線粒體功能進一步惡化后，又會持續(xù)激活炎癥反應，推動COPD進展。

與此同時，氧化應激會加重細胞損傷，并可誘導鐵死亡。鐵死亡是一種鐵依賴性、由脂質(zhì)過氧化驅(qū)動的程序性細胞死亡，其特征包括鐵蛋白重鏈（FTH）、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）、溶質(zhì)載體家族7成員11（SLC7A11）等關(guān)鍵標志物失衡，鐵依賴性脂質(zhì)過氧化物（LPOs）積累，以及高遷移率族蛋白B1（HMGB1）等損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）釋放。越來越多研究提示，鐵死亡參與COPD發(fā)生發(fā)展，并將鐵穩(wěn)態(tài)紊亂、氧化應激、炎癥反應與細胞功能持續(xù)受損聯(lián)系起來。炎癥、氧化應激和鐵死亡之間存在復雜交互，因此，同時靶向多個相互關(guān)聯(lián)通路的干預策略，可能比單一靶點治療具有更好的效果。

花生四烯酸（AA）代謝失衡與COPD發(fā)病密切相關(guān)，并可導致炎癥、脂質(zhì)過氧化和鐵死亡。在AA代謝通路中，AA可經(jīng)環(huán)氧合酶（COX）、脂氧合酶（LOX）和細胞色素P450（CYP）等多條酶促途徑代謝，生成多種類二十烷酸。近期研究進一步闡明了該通路中關(guān)鍵酶的作用。除經(jīng)典促炎功能外，前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2/COX-2）已被認為是鐵死亡的重要調(diào)控因子，可通過PTGS2-PGE2、NF-κB-PTGS2和PTGS2-AKR1C3-GPX4等信號軸促進脂質(zhì)過氧化。12/15-LOX也被報道為脂質(zhì)過氧化和鐵死亡的重要調(diào)控因子。值得注意的是，經(jīng)CYP介導AA代謝產(chǎn)生的環(huán)氧二十碳三烯酸（EETs）具有抗炎和抗氧化作用，例如通過CYP2J2生成；但EETs可被可溶性環(huán)氧化物水解酶（EPHX2/sEH）迅速代謝為相應的二羥基二十碳三烯酸（DHETs），而DHETs具有促炎和促氧化作用，可能進一步加重脂質(zhì)過氧化并促進鐵死亡信號。PTGS2、12/15-LOX、CYP2J2和EPHX2等關(guān)鍵酶因此被認為是COPD潛在治療靶點。

然而，目前COPD植物藥研究主要集中于PTGS2與12/15-LOX的雙重抑制，例如補肺活血膠囊和桑葉提取物的相關(guān)研究。相比之下，同時靶向PTGS2和EPHX2的植物藥研究仍較為空白。合成雙重抑制劑PTUPB可同時靶向PTGS2和EPHX2，并已在肺部疾病中顯示出一定潛力。例如，PTUPB可抑制巨噬細胞激活并下調(diào)炎癥相關(guān)基因，從而減輕急性肺損傷和COPD進展。此外，PTGS2和EPHX2雙重抑制還可顯著降低博來霉素誘導的肺泡上皮細胞中衰老相關(guān)分子表達。盡管如此，單一合成化合物的副作用風險和潛在藥代動力學局限不容忽視。同時，這種雙靶點抑制策略是否能在肺上皮細胞中產(chǎn)生類似保護作用，仍有待明確；而肺上皮細胞正是COPD損傷的主要發(fā)生部位。

傳統(tǒng)中藥（TCM）具有多成分、多靶點特點，為COPD等復雜呼吸系統(tǒng)疾病提供了有潛力的治療思路。清肺通絡(luò)方（QFTLF）源自麻杏石甘湯，后者是治療呼吸道感染的經(jīng)典方劑。近年來，清肺通絡(luò)方因其在呼吸系統(tǒng)疾病中的療效而被用于COPD治療。臨床研究顯示，清肺通絡(luò)方可顯著緩解SARS-CoV-2感染患者的咳嗽、咳痰等癥狀，緩解率約為89%。這些結(jié)果提示清肺通絡(luò)方可能具有治療COPD的潛力。不過，清肺通絡(luò)方發(fā)揮抗COPD作用的多靶點機制和活性物質(zhì)基礎(chǔ)，尤其是其是否調(diào)控PTGS2和EPHX2，仍未得到系統(tǒng)闡明，這限制了對其治療潛力的深入理解。

近年來，多組學方法為系統(tǒng)整合宏觀和微觀機制提供了有力工具，也為闡明中藥活性成分和作用機制提供了重要路徑。但多組學數(shù)據(jù)來自不同生物分析平臺，具有分布不統(tǒng)一、質(zhì)量差異大、動態(tài)范圍不同等特點；不同組學平臺還存在各自技術(shù)偏倚，并需要特定數(shù)據(jù)處理方法。因此，基因、轉(zhuǎn)錄本和蛋白在不同數(shù)據(jù)集之間的直接比較并不容易。多模態(tài)數(shù)據(jù)聯(lián)合分析可從不同維度提供互補生物學信息，從而更準確地排序關(guān)鍵基因和通路。計算機輔助藥物設(shè)計（CADD）包括誘導契合分子對接、分子動力學模擬、結(jié)合自由能和結(jié)合模式分析，結(jié)合SPR驗證，可有效評估小分子與受體相互作用的穩(wěn)定性、親和力和結(jié)合方式。這種整合策略有助于篩選主要活性成分，也為解析中藥干預靶點的物質(zhì)基礎(chǔ)和發(fā)現(xiàn)疾病治療候選化合物提供了可靠方法。

因此，為闡明清肺通絡(luò)方的分子機制和活性成分，尤其是其對PTGS2/EPHX2的雙重調(diào)控作用，并探究這種雙靶點抑制策略在緩解COPD相關(guān)炎癥和鐵死亡方面是否優(yōu)于單靶點干預，研究采用了整合方法，包括基于UPLC-MS/MS的血清藥物化學、多模態(tài)數(shù)據(jù)整合分析、CADD、SPR以及體內(nèi)外實驗驗證。研究結(jié)果表明，PTGS2/EPHX2雙重抑制可在COPD肺上皮細胞中發(fā)揮保護作用。清肺通絡(luò)方是一種新的天然來源PTGS2/EPHX2雙重抑制劑，具有多成分、多靶點優(yōu)勢，可通過恢復花生四烯酸代謝平衡，減輕COPD相關(guān)鐵死亡、炎癥反應和脂質(zhì)過氧化。研究還發(fā)現(xiàn)，7個入血成分構(gòu)成該作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，其中Vitexin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside顯示出作為PTGS2/EPHX2雙重抑制劑的潛力。整體而言，這些發(fā)現(xiàn)為開發(fā)同時靶向PTGS2/EPHX2的植物藥或藥物組合提供了策略基礎(chǔ)，也為清肺通絡(luò)方在COPD中的臨床應用提供了機制支持。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點

清肺通絡(luò)方的化學成分特征與質(zhì)量控制

研究首先采用正、負離子模式下的UPLC-MS/MS系統(tǒng)表征清肺通絡(luò)方提取物的化學組成。基于精確質(zhì)量數(shù)、MS/MS碎片模式以及與MWDB數(shù)據(jù)庫的保留時間匹配，研究共初步鑒定出442個化合物，其中正離子模式下檢測到277個，負離子模式下檢測到165個。這些成分主要包括172個黃酮類、88個生物堿、64個酚酸類、36個醌類、17個木脂素和香豆素類、8個萜類、2個鞣質(zhì)類以及55個其他化合物。這些結(jié)果為后續(xù)藥效和機制研究提供了植物化學基礎(chǔ)。

為保證清肺通絡(luò)方研究的重復性和質(zhì)量控制，作者選擇liquiritin、rhamnocitrin、chlorogenic acid、4-hydroxybenzoic acid和vanillin作為5個代表性定量標志物。選擇依據(jù)包括：這些成分在提取物中豐度較高且檢測穩(wěn)定；與COPD相關(guān)炎癥和氧化應激具有藥理學相關(guān)性；已報道存在于清肺通絡(luò)方組成藥材中；并且有標準品可用于可靠定量。根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫，這5個標志物分別關(guān)聯(lián)方中不同藥材來源，并覆蓋11味組成藥材中的6味，同時來自傳統(tǒng)“君臣佐使”配伍結(jié)構(gòu)中的不同角色。方法學驗證顯示，5個標志物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，日內(nèi)和日間精密度均低于10% RSD，回收率為93.51%至119.45%，符合接受標準。定量分析顯示，liquiritin、rhamnocitrin、chlorogenic acid、4-hydroxybenzoic acid和vanillin在清肺通絡(luò)方中的平均濃度分別為6.939、0.132、2.009、208.000和5.390 μmol/L。

圖1：基于UPLC-MS/MS對清肺通絡(luò)方（QFTLF）進行化學表征。A、B分別為清肺通絡(luò)方提取物在正離子（A）和負離子（B）模式下獲得的代表性總離子流色譜圖（TIC）。圖中標注了5個代表性定量標志物，包括liquiritin、rhamnocitrin、chlorogenic acid、4-hydroxybenzoic acid和vanillin，同時標出了它們的保留時間及相應藥材來源。

清肺通絡(luò)方改善COPD大鼠的肺功能、病理損傷和系統(tǒng)性炎癥

為系統(tǒng)評價清肺通絡(luò)方對LPS聯(lián)合香煙煙霧誘導COPD大鼠的治療作用，研究對大鼠連續(xù)灌胃不同劑量清肺通絡(luò)方28天，并以氨茶堿（AML）作為經(jīng)典陽性對照。評價內(nèi)容包括體重、肺組織外觀、呼吸功能、組織病理學、促炎細胞因子水平和凝血指標。

體重監(jiān)測顯示，香煙煙霧暴露使大鼠體重增長減慢，而清肺通絡(luò)方干預可改善這一變化。肺組織外觀觀察顯示，與模型組相比，清肺通絡(luò)方能夠改善LPS和香煙煙霧暴露導致的肺體積增大以及肺表面暗紅改變。組織病理學檢查進一步顯示，模型組出現(xiàn)嚴重肺泡隔斷裂、支氣管平滑肌增厚、支氣管周圍炎癥細胞浸潤、膠原沉積、血管平滑肌增生、杯狀細胞化生和黏蛋白分泌增加等病理改變；清肺通絡(luò)方處理后，上述病變明顯減輕。肺功能檢測顯示，模型組EF50、PEF、EV、TV、AV和PIF下降，同時呼吸頻率F升高；清肺通絡(luò)方可在不同程度上緩解這些功能損傷。系統(tǒng)性炎癥方面，清肺通絡(luò)方顯著降低大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎細胞因子水平。支氣管肺泡灌洗液（BALF）總細胞計數(shù)顯示，模型組細胞數(shù)明顯升高，而清肺通絡(luò)方可降低這一變化。凝血指標檢測顯示，清肺通絡(luò)方顯著降低升高的纖維蛋白原（Fib），并逆轉(zhuǎn)香煙煙霧暴露導致的凝血酶原時間（PT）和活化部分凝血活酶時間（APTT）縮短?？傮w而言，清肺通絡(luò)方通過改善呼吸功能、減輕肺泡、支氣管和血管病理損傷，并降低系統(tǒng)性炎癥，表現(xiàn)出較全面的抗COPD作用。

圖2：清肺通絡(luò)方減輕脂多糖（LPS）和香煙煙霧（CS）誘導的COPD相關(guān)大鼠病理改變。A，COPD大鼠模型建立及給藥流程。B，實驗期間大鼠體重變化（n = 6）。C，各組大鼠代表性肺組織形態(tài)圖像（n = 6）。D，肺組織HE染色、Masson染色和AB-PAS染色代表性圖像。E，呼吸功能評價（n = 6）。F，大鼠血清促炎細胞因子檢測（n = 6）。G，大鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）總細胞計數(shù)（n = 4）。H，大鼠血漿凝血指標檢測（n = 3）。數(shù)據(jù)以均值 ± 標準差表示。*p < 0.05，**p < 0.01，與COPD模型組（MOD）相比。

清肺通絡(luò)方原型入血成分的鑒定與靶點預測

作為一個高度復雜的中藥復方，明確哪些成分能夠進入血清，是研究清肺通絡(luò)方抗COPD機制的關(guān)鍵。研究采用UPLC-MS/MS比較清肺通絡(luò)方提取物、空白血清和清肺通絡(luò)方含藥血清在正、負離子模式下的TIC圖譜。前文已在清肺通絡(luò)方提取物中鑒定出442個化合物；在清肺通絡(luò)方含藥血清中，共檢測到414個化合物，包括63個酚酸類、147個黃酮類、34個醌類、14個木脂素和香豆素類、89個生物堿、8個萜類、2個鞣質(zhì)類和57個其他成分。進一步分析顯示，血清中檢測到60個成分，其中58個被鑒定為原型入血成分，包括5個酚酸類、36個黃酮類、3個醌類、1個木脂素/香豆素類、4個生物堿、1個萜類和8個其他成分。隨后，研究利用SwissTargetPrediction預測這58個原型成分的潛在靶點，最終獲得123個潛在靶點，并進一步構(gòu)建了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。

圖3：清肺通絡(luò)方原型入血成分的鑒定。A，清肺通絡(luò)方提取物、空白血清和清肺通絡(luò)方含藥血清（QFTLF serum）在正離子（P）和負離子（N）模式下的疊加TIC圖譜。B，清肺通絡(luò)方提取物與清肺通絡(luò)方含藥血清中化合物類別的比較分析。C，清肺通絡(luò)方原型入血成分的鑒定及分類圖。

轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學揭示清肺通絡(luò)方抗COPD的潛在調(diào)控機制

為進一步探索清肺通絡(luò)方治療COPD的潛在機制，研究開展了轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學分析。轉(zhuǎn)錄組學中，研究將FC > 1.5或 < 1/1.5且p < 0.05的基因定義為差異表達基因（DEGs）。結(jié)果顯示，在MOD與CON比較中，發(fā)現(xiàn)256個上調(diào)DEGs和180個下調(diào)DEGs；在QFTLF與MOD比較中，發(fā)現(xiàn)25個上調(diào)DEGs和135個下調(diào)DEGs。其中，共有63個DEGs在QFTLF vs. MOD vs. CON比較中呈現(xiàn)“V”形或“Λ”形表達趨勢。對這些趨勢顯著DEGs進行GO和KEGG富集分析后發(fā)現(xiàn)，相關(guān)生物過程主要涉及免疫反應、補體激活、免疫球蛋白介導的免疫反應等；細胞組分主要涉及免疫球蛋白復合物、細胞外空間和細胞表面；分子功能主要涉及抗原結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性和蛋白酶結(jié)合。KEGG分析識別出5條潛在調(diào)控通路，包括補體和凝血級聯(lián)、亞油酸代謝、花生四烯酸代謝、金黃色葡萄球菌感染以及炎癥介質(zhì)調(diào)控TRP通道。

蛋白質(zhì)組學中，研究將FC > 1.2或 < 1/1.2且p < 0.05的蛋白定義為差異表達蛋白（DEPs）。結(jié)果顯示，MOD與CON比較中發(fā)現(xiàn)183個上調(diào)DEPs和636個下調(diào)DEPs；QFTLF與MOD比較中發(fā)現(xiàn)438個上調(diào)DEPs和136個下調(diào)DEPs。其中，共有197個DEPs在QFTLF vs. MOD vs. CON比較中呈現(xiàn)“V”形或“Λ”形表達趨勢。GO分析提示，這些DEPs相關(guān)的關(guān)鍵生物過程包括蛋白質(zhì)靶向和鈣黏蛋白介導的細胞-細胞黏附負調(diào)控；關(guān)鍵細胞組分包括細胞質(zhì)、胞質(zhì)溶膠和軸絲微管；關(guān)鍵分子功能包括蛋白結(jié)合、蛋白同源二聚化活性和SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合。KEGG分析識別出20條潛在調(diào)控通路，包括糖尿病性心肌病、NOD樣受體信號通路、多種神經(jīng)退行性疾病通路、氧化磷酸化和三羧酸循環(huán)（TCA cycle）。整體來看，轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學結(jié)果提示，清肺通絡(luò)方主要通過調(diào)控炎癥、免疫反應和代謝等關(guān)鍵生物學功能，以及25條潛在通路來緩解COPD。

圖4：轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學分析揭示清肺通絡(luò)方抗COPD的潛在機制。A，轉(zhuǎn)錄組學差異表達基因（DEGs）火山圖（FC > 1.5或 < 1/1.5，p < 0.05）。B，識別在CON、MOD和QFTLF組之間呈“V”形（藍色）或“Λ”形（粉色）表達趨勢的DEGs。C，B中趨勢顯著DEGs的聚類熱圖。D、E，趨勢顯著DEGs的GO和KEGG通路富集分析（p < 0.05）。F，蛋白質(zhì)組學差異表達蛋白（DEPs）火山圖（FC > 1.2或 < 1/1.2，p < 0.05）。G，識別三組之間呈“V”形（藍色）或“Λ”形（粉色）表達趨勢的DEPs。H，G中趨勢顯著DEPs的聚類熱圖。I、J，趨勢顯著DEPs的GO和KEGG通路富集分析（p < 0.05）。

多模態(tài)數(shù)據(jù)整合鎖定清肺通絡(luò)方原型入血成分調(diào)控的核心通路和靶點

轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學結(jié)果顯示，清肺通絡(luò)方治療COPD的潛在調(diào)控功能具有較高一致性。為進一步明確原型入血成分調(diào)控的核心機制、靶點和細胞類型，研究進行了多模態(tài)數(shù)據(jù)分析。

首先，研究對各比較組中的DEGs和DEPs進行Spearman相關(guān)分析，以評估轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組表達趨勢的一致性。結(jié)果顯示，兩類數(shù)據(jù)整體相關(guān)性較強。在MOD vs. CON組的357,956個基因-蛋白對中，32.17%呈正相關(guān)，37.32%呈負相關(guān)；在QFTLF vs. MOD組的92,879個基因-蛋白對中，21.93%呈正相關(guān)，48.19%呈負相關(guān)。這為后續(xù)整合分析提供了可靠基礎(chǔ)。隨后，研究通過Venn分析整合轉(zhuǎn)錄組學識別的5條潛在調(diào)控通路中的基因、蛋白質(zhì)組學識別的20條潛在調(diào)控通路中的基因，以及原型入血成分相關(guān)靶基因，篩選出4個潛在關(guān)鍵靶點：PTGS2、EPHX2、PRKCG和ADCY2。

進一步地，研究將這4個潛在關(guān)鍵靶點與上述25條潛在通路整合分析，將受超過2個潛在關(guān)鍵靶點調(diào)控的通路定義為原型入血成分調(diào)控的關(guān)鍵通路。結(jié)果共識別出4條潛在關(guān)鍵通路，包括花生四烯酸代謝、炎癥介質(zhì)調(diào)控TRP通道、糖尿病性心肌病以及多種神經(jīng)退行性疾病通路。隨后，研究利用PS-V2N算法構(gòu)建由4條關(guān)鍵通路和58個成分組成的復雜基因網(wǎng)絡(luò)，并進行基因優(yōu)先級排序。鑒于花生四烯酸代謝失衡與COPD發(fā)病密切相關(guān)，且調(diào)節(jié)該通路可有效緩解香煙煙霧誘導的COPD表型，本研究將花生四烯酸代謝通路作為后續(xù)研究的潛在核心通路。PS-V2N復雜網(wǎng)絡(luò)分析顯示，在清肺通絡(luò)方原型入血成分調(diào)控花生四烯酸代謝通路的前20個靶點中，PTGS2和EPHX2排名前兩位，是該通路中的核心調(diào)控靶點。

GSEA進一步顯示，QFTLF組相較MOD組的花生四烯酸代謝通路呈下調(diào)趨勢（NES = ?1.252，F(xiàn)DR q-val = 0.144）。Leading-edge子集分析顯示，PTGS2和EPHX2在負向端核心富集，是該通路受到抑制的主要驅(qū)動因子；而CYP2J4在正向端核心富集并顯著上調(diào)（Log?FC = 0.8528，p < 0.05），提示清肺通絡(luò)方可能同時激活該通路中的保護性調(diào)控機制。PPI網(wǎng)絡(luò)分析進一步突出PTGS2、EPHX2和CYP2J4的中心作用，尤其是PTGS2作為核心樞紐節(jié)點。PTGS2、EPHX2和CYP2J4在轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組層面呈現(xiàn)一致調(diào)控趨勢：在QFTLF vs. MOD轉(zhuǎn)錄組比較中，PTGS2、EPHX2和CYP2J4的FC分別為0.5381、0.70697和1.8060；在蛋白質(zhì)組層面，相應FC分別為0.7568、0.8939和1.706。綜合來看，花生四烯酸代謝是清肺通絡(luò)方原型入血成分調(diào)控的核心通路，PTGS2和EPHX2是核心靶點，CYP2J4可能參與該通路中的保護性調(diào)控。

圖5：多模態(tài)數(shù)據(jù)整合揭示清肺通絡(luò)方原型入血成分相關(guān)的核心通路和靶點。A，不同比較組中DEGs和DEPs的Spearman相關(guān)分析（|r|≥0.7表示強相關(guān)）。B，Venn圖顯示原型入血成分調(diào)控的關(guān)鍵靶點，該分析整合了調(diào)控通路基因和成分相關(guān)基因。C，基于關(guān)鍵靶基因顯示原型入血成分調(diào)控關(guān)鍵通路的柱狀圖。D，基于頂點到網(wǎng)絡(luò)鄰近評分（PS-V2N）的復雜基因網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)來源于原型入血成分和關(guān)鍵通路。E，PS-V2N對花生四烯酸代謝通路相關(guān)基因進行優(yōu)先級排序。F，QFTLF vs. MOD組中花生四烯酸代謝通路的基因集富集分析（GSEA），并展示核心富集基因熱圖和PPI網(wǎng)絡(luò)分析。G，假設(shè)示意圖，展示CS和QFTLF對花生四烯酸代謝通路的調(diào)控。

單細胞RNA測序驗證核心通路和靶點，并識別關(guān)鍵細胞類型

為驗證上述核心機制并確定其在人體COPD中的細胞定位，研究分析了兩個公開單細胞RNA測序數(shù)據(jù)集。首先，研究分析了來源于6例COPD患者肺組織的GSE269390數(shù)據(jù)集。經(jīng)Seurat進行降維和細胞聚類后，識別出8類主要細胞。ScMetabolism代謝分析顯示，不同細胞群具有不同代謝特征，其中花生四烯酸代謝在巨噬細胞、樹突狀細胞、內(nèi)皮細胞和Ⅱ型肺泡上皮細胞（AT2 cells）中顯著富集。鑒于花生四烯酸代謝與鐵死亡密切相關(guān)，研究進一步考察了PTGS2、EPHX2、CYP2J2和GPX4等關(guān)鍵基因的細胞分布。其中，CYP2J2是小鼠Cyp2j4的人同源基因，后文統(tǒng)一稱為CYP2J2。結(jié)果顯示，這些基因主要表達于上皮細胞類型，尤其是AT2細胞和纖毛細胞，提示核心通路和靶點的定位可能集中于AT2細胞。沿AT2細胞擬時序軌跡分析顯示，核心基因在AT2細胞分化過程中保持相對穩(wěn)定。細胞通訊分析進一步提示，AT2細胞與巨噬細胞之間的通訊對花生四烯酸代謝具有重要意義。

為進一步評估COPD與健康個體AT2細胞中花生四烯酸代謝及相關(guān)基因是否存在差異，研究分析了另一個scRNA-seq數(shù)據(jù)集GSE222374，該數(shù)據(jù)集包括6例COPD患者和4名健康對照的EPCAM陽性活上皮細胞轉(zhuǎn)錄組，共包含81,896個細胞，分為9類主要細胞類型，其中AT2細胞為78,699個。氣泡圖顯示，COPD AT2細胞中花生四烯酸代謝顯著上調(diào)。GSVA評分進一步證實，與健康A(chǔ)T2細胞相比，COPD AT2細胞中該通路顯著升高（p < 2.22e-16）。在基因?qū)用?，PTGS2和EPHX2在COPD AT2細胞中顯著上調(diào)，而CYP2J2和GPX4顯著下調(diào)（p < 0.0001）。這些發(fā)現(xiàn)與COPD大鼠中觀察到的通路和靶基因改變一致。

圖6：單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析驗證人體COPD中的核心通路和靶點，并識別關(guān)鍵細胞類型。A，均勻流形近似與投影（UMAP）可視化圖，顯示COPD患者肺組織中識別出的8類主要細胞。B，基于scMetabolism分析的氣泡圖，顯示不同細胞類型中前30個代謝通路的活性。C，小提琴圖顯示PTGS2、EPHX2、CYP2J2和GPX4在不同細胞類型中的表達水平。D，肺上皮scRNA-seq數(shù)據(jù)集中細胞分布的UMAP可視化圖。E，不同組別和上皮細胞類型中花生四烯酸代謝基因集的基因集變異分析（GSVA）富集評分。F，小提琴圖比較健康組與COPD組Ⅱ型肺泡上皮細胞（AT2）中花生四烯酸代謝通路評分。G，小提琴圖顯示健康組與COPD組AT2細胞中PTGS2、EPHX2、CYP2J2和GPX4的差異表達水平。

體內(nèi)驗證清肺通絡(luò)方對花生四烯酸代謝相關(guān)機制的調(diào)控

在多模態(tài)數(shù)據(jù)整合基礎(chǔ)上，研究進一步通過體內(nèi)實驗驗證花生四烯酸代謝相關(guān)核心機制。首先，作者采用PERLS-DAB染色觀察清肺通絡(luò)方對COPD大鼠肺組織鐵沉積的影響。結(jié)果顯示，與CON組相比，MOD組肺組織鐵沉積顯著增加（p < 0.01）；清肺通絡(luò)方處理可不同程度減少鐵沉積（p < 0.01），這一結(jié)果與Fe2?定量檢測結(jié)果一致。

隨后，研究評估清肺通絡(luò)方對大鼠肺組織脂質(zhì)過氧化的影響。生化試劑盒結(jié)果顯示，清肺通絡(luò)方顯著提高COPD大鼠肺組織中T-SOD和GSH水平（p < 0.01），同時降低MDA水平（p < 0.01）。研究還檢測了14,15-EET、14,15-DHET、11,12-EET和11,12-DHET等花生四烯酸代謝物。結(jié)果顯示，香煙煙霧暴露后，清肺通絡(luò)方干預顯著升高肺組織中11,12-EET水平（p < 0.05），并降低11,12-DHET水平（p < 0.01）；但14,15-EET和14,15-DHET在CS暴露或清肺通絡(luò)方干預后均未發(fā)生顯著變化。這提示清肺通絡(luò)方可能通過調(diào)節(jié)花生四烯酸代謝，減少CS暴露后大鼠肺組織脂質(zhì)過氧化及后續(xù)鐵死亡。

為在組織水平驗證關(guān)鍵靶基因表達，研究對大鼠肺組織中PTGS2和EPHX2進行免疫熒光分析，并與ProSPC，即Ⅱ型肺泡上皮細胞特異性標志物pro-surfactant protein C，共定位。結(jié)果顯示，與CON組相比，MOD組肺組織PTGS2和EPHX2表達均顯著升高；清肺通絡(luò)方干預后，這一升高明顯減弱。共定位分析證實，上調(diào)的PTGS2和EPHX2主要表達于ProSPC陽性AT2細胞。WB分析進一步驗證了清肺通絡(luò)方對PTGS2和EPHX2表達的調(diào)節(jié)作用。為進一步明確清肺通絡(luò)方調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化是否與抑制PTGS2-PPARγ-CYP2J2和EPHX2介導通路有關(guān)，研究繼續(xù)進行WB檢測。結(jié)果顯示，清肺通絡(luò)方顯著降低COPD大鼠肺組織HMGB1和TNFα表達，同時升高PPARγ、p-PPARγ、CYP2J2和GPX4水平；PTGS2表達在清肺通絡(luò)方干預后呈下降趨勢。上述結(jié)果提示，清肺通絡(luò)方可能通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化和炎癥反應，減輕COPD肺組織鐵死亡，這一作用與抑制PTGS2-PPARγ-CYP2J2和EPHX2介導通路有關(guān)，而AT2細胞可能是該過程中的主要調(diào)控細胞。

圖7：體內(nèi)驗證清肺通絡(luò)方在COPD保護作用中涉及的花生四烯酸代謝相關(guān)機制。A，PERLS-DAB染色顯示大鼠肺組織鐵沉積（比例尺 = 20 μm）。B，清肺通絡(luò)方處理后大鼠肺組織Fe2?水平。C，大鼠肺組織脂質(zhì)過氧化相關(guān)指標（T-SOD、MDA和GSH）。D，ELISA分析大鼠肺組織中花生四烯酸來源脂質(zhì)代謝物（14,15-EET、14,15-DHET、11,12-EET和11,12-DHET）。E，大鼠肺組織中PTGS2與pro-surfactant protein C（ProSPC，AT2細胞標志物）的免疫熒光染色（ProSPC為紅色，PTGS2為綠色，DAPI為藍色；比例尺 = 50 μm）。F，大鼠肺組織中EPHX2與ProSPC的免疫熒光染色（ProSPC為紅色，EPHX2為綠色，DAPI為藍色；比例尺 = 50 μm）。G，大鼠肺組織中PTGS2和EPHX2熒光強度定量。H，大鼠肺組織中PTGS2、EPHX2及下游通路相關(guān)蛋白的Western blot分析。數(shù)據(jù)以均值 ± 標準差表示。*p < 0.05，**p < 0.01，與MOD組相比。生化和免疫熒光分析n = 6；Western blot分析n = 3。

體外確定CSE和清肺通絡(luò)方含藥血清的最佳干預條件

為進一步研究清肺通絡(luò)方對關(guān)鍵機制的調(diào)控，作者開展了體外實驗。由于體內(nèi)結(jié)果提示AT2細胞可能是清肺通絡(luò)方的主要調(diào)控細胞，研究首先采用CCK-8實驗篩選香煙煙霧提取物（CSE）和清肺通絡(luò)方含藥血清作用于AT2細胞相關(guān)細胞系MLE-12和A549的最佳劑量和時間。結(jié)果顯示，CSE以劑量和時間依賴方式顯著降低兩種細胞活力；2.5% CSE處理24 h后，MLE-12和A549細胞活力降至約70%（p < 0.01），這一條件被廣泛用于誘導上皮細胞損傷，因此研究選擇2.5% CSE處理24 h用于后續(xù)實驗。

血清篩選顯示，與10% FBS相比，5%、10%、15%和20%清肺通絡(luò)方含藥血清均顯著提高MLE-12細胞活力（p < 0.01），但在A549細胞中未見顯著保護作用。由于前期scRNA-seq結(jié)果提示QFTLF靶向的核心通路和基因主要位于AT2細胞，且MLE-12細胞對清肺通絡(luò)方含藥血清反應更明顯，研究選擇MLE-12細胞用于后續(xù)機制驗證。綜合體內(nèi)研究采用的臨床等效劑量，以及體外CCK-8結(jié)果，后續(xù)實驗采用10%清肺通絡(luò)方含藥血清作為干預濃度。

研究還在BEAS-2B細胞和RAW264.7細胞中進行了類似篩選，以評估不同細胞類型對CSE和清肺通絡(luò)方含藥血清的反應。2.5% CSE處理24 h同樣降低這兩種細胞活力，但清肺通絡(luò)方含藥血清未表現(xiàn)出明顯保護作用。隨后，為驗證MLE-12細胞中CSE誘導損傷與鐵死亡相關(guān)，研究使用鐵死亡抑制劑Fer-1以及鐵死亡誘導劑Erastin和RSL3。結(jié)果顯示，F(xiàn)er-1可改善CSE誘導的細胞活力下降，而Erastin和RSL3進一步加重CSE誘導的細胞活力降低；同時，CSE導致Fe2?升高和GSH下降，而清肺通絡(luò)方含藥血清可改善這些變化。上述結(jié)果支持后續(xù)以CSE誘導MLE-12細胞損傷作為體外模型，研究清肺通絡(luò)方對鐵死亡和花生四烯酸代謝的影響。

圖8：確定不同細胞類型中香煙煙霧提取物（CSE）和清肺通絡(luò)方含藥血清的最佳暴露條件。A–C，采用CCK-8法檢測MLE-12和A549細胞暴露于CSE和/或清肺通絡(luò)方含藥血清后的細胞活力。D–F，采用CCK-8法檢測B2B和RAW264.7細胞暴露于CSE和/或清肺通絡(luò)方含藥血清后的細胞活力。G，鐵死亡相關(guān)調(diào)節(jié)劑Fer-1、Erastin和RSL3處理24 h后對MLE-12細胞活力的影響。H，不同藥物處理24 h后對MLE-12細胞活力的影響。I，不同藥物處理24 h后MLE-12細胞內(nèi)Fe2?和GSH水平。數(shù)據(jù)以均值 ± 標準差表示（n ≥ 3）。A和D中，與CSE 0%組比較；B和E中，與FBS 10%組比較；C和F中，與相應CSE處理組比較；G–I中，與對照組（*、**）或CSE組（#、##）比較。*p < 0.05，**p < 0.01； < 0.05，# < 0.01。

清肺通絡(luò)方含藥血清在CSE暴露MLE-12細胞中調(diào)控花生四烯酸代謝并減輕鐵死亡

在體外機制驗證中，CSE處理使MLE-12細胞內(nèi)Fe2?顯著升高，而清肺通絡(luò)方含藥血清可降低這一積累。脂質(zhì)過氧化相關(guān)指標檢測顯示，CSE誘導MDA升高，同時降低T-SOD和GSH；清肺通絡(luò)方含藥血清能夠逆轉(zhuǎn)這些改變。BODIPY 581/591 C11染色和流式細胞術(shù)進一步證實，CSE顯著提高細胞脂質(zhì)過氧化水平，而清肺通絡(luò)方含藥血清可降低脂質(zhì)過氧化程度。

ELISA檢測花生四烯酸代謝物顯示，CSE處理后，MLE-12細胞中11,12-EET下降、11,12-DHET升高，提示保護性EETs與有害DHETs之間的平衡被破壞；清肺通絡(luò)方含藥血清則提高11,12-EET并降低11,12-DHET，從而部分恢復花生四烯酸代謝平衡。免疫熒光顯示，CSE可誘導PTGS2和EPHX2表達增強，而清肺通絡(luò)方含藥血清可降低其表達。Western blot進一步顯示，清肺通絡(luò)方含藥血清可調(diào)節(jié)PTGS2、EPHX2及下游通路相關(guān)蛋白，提示其體外作用與體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一致。

圖9：體外驗證清肺通絡(luò)方含藥血清在CSE暴露MLE-12細胞中對花生四烯酸代謝的調(diào)控作用。除特別說明外，所有檢測均在清肺通絡(luò)方含藥血清處理24 h后進行。A，細胞內(nèi)Fe2?水平（n = 6）。B，脂質(zhì)過氧化相關(guān)指標（MDA、T-SOD和GSH）（n = 6）。C，BODIPY 581/591 C11染色顯示MLE-12細胞脂質(zhì)過氧化的代表性共聚焦圖像，比例尺 = 50 μm（n = 6）。D，基于BODIPY 581/591 C11染色，通過流式細胞術(shù)定量脂質(zhì)過氧化（n = 3）。E，ELISA分析花生四烯酸代謝物（14,15-EET、14,15-DHET、11,12-EET和11,12-DHET）（n = 6）。F，MLE-12細胞中PTGS2表達（紅色）的共聚焦免疫熒光圖像；細胞核采用DAPI染色（藍色），比例尺 = 50 μm。G，MLE-12細胞中EPHX2表達（紅色）的共聚焦免疫熒光圖像；細胞核采用DAPI染色（藍色），比例尺 = 50 μm。H，PTGS2、EPHX2及下游通路相關(guān)蛋白的Western blot分析（n = 3）。數(shù)據(jù)以均值 ± 標準差表示。*p < 0.05，**p < 0.01，與CSE（2.5%）組相比。

PTGS2和EPHX2抑制劑模擬清肺通絡(luò)方的保護效應

為進一步判斷清肺通絡(luò)方的保護作用是否依賴PTGS2和EPHX2抑制，研究采用PTGS2選擇性抑制劑Celecoxib和EPHX2選擇性抑制劑GSK2256294A作為藥理學對照。MLE-12細胞在2.5% CSE存在條件下，分別聯(lián)合10%清肺通絡(luò)方含藥血清、Celecoxib（25 μM）或GSK2256294A（25 μM）處理。結(jié)果顯示，清肺通絡(luò)方含藥血清、Celecoxib和GSK2256294A均顯著減輕CSE誘導的Fe2?積累（p < 0.01）。脂質(zhì)過氧化檢測也顯示，三種處理均可顯著抵消CSE誘導的MDA升高，以及GSH和T-SOD活性下降（p < 0.01）。Western blot進一步證實，清肺通絡(luò)方含藥血清、Celecoxib和GSK2256294A均可降低CSE誘導升高的促炎細胞因子IL-1β和TNF-α蛋白水平，并恢復抗鐵死亡蛋白GPX4表達。

這些結(jié)果說明，分別藥理性抑制PTGS2或EPHX2，均可重復清肺通絡(luò)方抵抗CSE誘導鐵死亡、脂質(zhì)過氧化和炎癥反應的核心保護效應，從而支持清肺通絡(luò)方通過PTGS2和EPHX2雙重抑制發(fā)揮作用的中心假設(shè)。并且，在調(diào)控脂質(zhì)過氧化和炎癥反應方面，清肺通絡(luò)方的雙靶點抑制作用似乎優(yōu)于單一靶點抑制。

圖10：清肺通絡(luò)方含藥血清及PTGS2/EPHX2抑制劑對CSE暴露MLE-12細胞中鐵死亡、脂質(zhì)過氧化和炎癥反應的影響。A，在2.5% CSE存在條件下，清肺通絡(luò)方含藥血清、Celecoxib（25 μM）或GSK2256294A（25 μM）處理24 h后，MLE-12細胞內(nèi)Fe2?水平（n = 6）。B，處理24 h后MLE-12細胞脂質(zhì)過氧化相關(guān)指標（MDA、T-SOD和GSH）（n = 6）。C，處理24 h后MLE-12細胞中促炎細胞因子（IL-1β、TNF-α）和抗鐵死亡蛋白GPX4的Western blot分析（n = 3）。數(shù)據(jù)以均值 ± 標準差表示。*p < 0.05，**p < 0.01，與CSE（2.5%）組相比。

計算篩選并驗證靶向PTGS2/EPHX2的關(guān)鍵活性成分

鑒于清肺通絡(luò)方原型入血成分復雜，研究采用誘導契合分子對接（IFD）探索清肺通絡(luò)方作用于PTGS2和EPHX2的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究將對接評分≤?5 kcal/mol的化合物視為潛在活性化合物?；谶@一標準，在58個清肺通絡(luò)方原型入血成分中，分別有53個和52個成分顯示出對PTGS2和EPHX2的潛在抑制活性。已知陽性對照藥物的對接評分進一步驗證了計算體系對已知特異性相互作用建模的準確性。值得注意的是，每個靶點排名前20位的對接化合物，其對接評分與相應陽性對照相當或更優(yōu)，因此被選為候選關(guān)鍵成分。

考慮到這些化合物結(jié)構(gòu)多樣，研究進一步基于結(jié)構(gòu)指紋進行層次聚類分析，將PTGS2和EPHX2排名前20位的對接化合物分別劃分為5個聚類。綜合考慮各聚類中的化合物數(shù)量、主要藥材來源、《中華人民共和國藥典》及相關(guān)文獻中的記載、化合物可購買性，以及“君臣佐使”配伍原則，研究最終分別選擇5個潛在關(guān)鍵成分靶向PTGS2和EPHX2。PTGS2相關(guān)關(guān)鍵成分為Narcissoside、Mudanpioside C、Baicalin、Vitexin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside；EPHX2相關(guān)關(guān)鍵成分為Hamamelitannin、Choerospondin、Vitexin、Nepitrin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside。

為評估結(jié)合穩(wěn)定性，研究對PTGS2和EPHX2復合體系進行了100 ns分子動力學模擬。RMSD結(jié)果顯示，PTGS2與Narcissoside、Baicalin、Vitexin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside形成的復合體系在100 ns模擬中波動保持在一定范圍內(nèi)；Mudanpioside C-PTGS2復合體系在30 ns前有一定波動，但30 ns后至模擬結(jié)束保持穩(wěn)定。RMSF結(jié)果也顯示，不同復合體系中蛋白整體波動趨勢趨于穩(wěn)定。EPHX2與Hamamelitannin、Choerospondin、Vitexin、Nepitrin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside形成的復合物同樣表現(xiàn)出良好穩(wěn)定性。結(jié)合自由能計算進一步支持這些關(guān)鍵成分與PTGS2和EPHX2具有較高結(jié)合親和力，并可形成穩(wěn)定復合物。

圖11：計算鑒定并驗證靶向PTGS2/EPHX2的關(guān)鍵化合物。A，清肺通絡(luò)方原型入血成分中與PTGS2和EPHX2對接評分最高的前20個化合物。B，與PTGS2對接的前20個原型入血成分的層次聚類分析。C，與EPHX2對接的前20個原型入血成分的層次聚類分析。D，PTGS2-關(guān)鍵化合物復合物在100 ns模擬過程中的均方根偏差（RMSD）和均方根波動（RMSF）曲線。E，EPHX2-關(guān)鍵化合物復合物在100 ns模擬過程中的RMSD和RMSF曲線。

SPR實驗驗證關(guān)鍵成分與PTGS2/EPHX2的結(jié)合能力

為實驗驗證關(guān)鍵化合物與PTGS2和EPHX2的結(jié)合特征，研究采用SPR測定其親和力。平衡解離常數(shù)（KD）顯示，對于PTGS2，Baicalin親和力最強（5.69 × 10?? M），其次為Vitexin（6.00 × 10?? M）、Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside（7.49 × 10?? M）、Mudanpioside C（8.24 × 10?? M）和Narcissoside（76.93 × 10?? M）。對于EPHX2，Hamamelitannin（6.58 × 10?? M）和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside（5.75 × 10?? M）親和力最高，其次為Choerospondin（10.71 × 10?? M）、Vitexin（12.70 × 10?? M）和Nepitrin（48.97 × 10?? M）。所有結(jié)合曲線均表現(xiàn)出特異性分子相互作用的典型特征，包括清晰的劑量依賴性響應和飽和結(jié)合，說明這些信號更可能來自有限結(jié)合位點介導的特異性結(jié)合，而非非特異性吸附。

研究進一步利用PyMOL分析關(guān)鍵活性成分與靶點蛋白結(jié)合腔中的相互作用模式。PTGS2結(jié)合口袋中，不同成分形成了不同氫鍵網(wǎng)絡(luò)：Narcissoside與VAL83、TYR352、ARG480和GLU491形成穩(wěn)定氫鍵；Mudanpioside C主要通過ASP157、ASP482、ILE484和PHE485形成4個氫鍵；Baicalin和Vitexin分別與MET490和TYR353形成關(guān)鍵氫鍵；Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside則與TYR322、TYR352、PHE485和SER497形成氫鍵。EPHX2結(jié)合模式分析顯示，關(guān)鍵殘基在與化合物形成氫鍵中具有保守且特異的作用。ASP104是重要樞紐殘基，可分別與Hamamelitannin、Choerospondin和Vitexin形成穩(wěn)定氫鍵，并與SER184、MET138/GLN153和PHE266配對。ASN128和GLN153參與Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside的氫鍵作用。Nepitrin表現(xiàn)出最廣泛的相互作用網(wǎng)絡(luò)，與ASP104、LEU177、SER181、SER184、LEU186、TYR235、LYN264和PHE266等殘基形成8個氫鍵。

綜合來看，關(guān)鍵成分能夠穩(wěn)定結(jié)合相應靶點。對于PTGS2，Mudanpioside C、Baicalin、Vitexin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside具有穩(wěn)定結(jié)合證據(jù)，包括較好的SPR來源KD值、典型劑量依賴性傳感圖和特異性氫鍵網(wǎng)絡(luò)。對于EPHX2，Hamamelitannin、Choerospondin、Vitexin、Nepitrin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside也通過一致的生物物理和結(jié)構(gòu)證據(jù)顯示出穩(wěn)定結(jié)合。值得注意的是，Vitexin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside表現(xiàn)出作為PTGS2/EPHX2雙重抑制劑的潛力。

圖12：關(guān)鍵靶向PTGS2和EPHX2化合物的實驗驗證與機制分析。A，表面等離子體共振（SPR）傳感圖，顯示關(guān)鍵化合物與PTGS2蛋白相互作用的代表性結(jié)合曲線、KD值以及結(jié)合/解離速率。數(shù)據(jù)以均值 ± 標準差表示（n = 3），空白傳感芯片上未檢測到顯著結(jié)合響應。B，SPR傳感圖，顯示關(guān)鍵化合物與EPHX2蛋白相互作用的代表性結(jié)合曲線、KD值以及結(jié)合/解離速率。數(shù)據(jù)以均值 ± 標準差表示（n = 3），空白傳感芯片上未檢測到顯著結(jié)合響應。C，關(guān)鍵化合物與PTGS2復合物的結(jié)合相互作用模式分析。D，關(guān)鍵化合物與EPHX2復合物的結(jié)合相互作用模式分析。

關(guān)鍵成分的藥代動力學性質(zhì)預測與機制示意圖總結(jié)

為評估候選化合物的成藥性和初步安全性，研究采用SwissADME和ProTox 3.0預測這些PTGS2/EPHX2靶向化合物的理化性質(zhì)、藥代動力學和毒性。毒性預測顯示，多數(shù)化合物被歸為Class V，而Hamamelitannin和Vitexin被歸為Class IV，提示這些天然化合物整體具有相對有利的初步安全性。藥代動力學預測顯示，所有關(guān)鍵化合物的胃腸道吸收均較低，提示其口服生物利用度可能存在限制。其他相關(guān)理化性質(zhì)，包括親脂性、水溶性和成藥性參數(shù)，也在研究中進行了總結(jié)。SPR和CADD驗證的穩(wěn)定靶點結(jié)合能力，加上較有利的初步安全性，支持這些成分作為天然抗COPD先導化合物的潛力；但低口服生物利用度也提示，未來可能需要通過制劑和遞送策略進行優(yōu)化。

圖13：清肺通絡(luò)方及其靶向PTGS2/EPHX2的活性成分抗COPD作用機制示意圖。

【Citation】:Wang Y, Tian Y, Bai J, Zhao J, Sun H, Hu G, Yao J, Liu X, Zhang Z, Jin X, Liu Y. Qingfei Tongluo Formula attenuates COPD-associated ferroptosis by restoring arachidonic acid metabolic balance via dual inhibition of prostaglandin-endoperoxide synthase 2 and soluble epoxide hydrolase 2.Phytomedicine.2026;157:158302.

【貢獻】★★★★★

總體而言，本研究通過整合多模態(tài)數(shù)據(jù)，創(chuàng)新性地證明清肺通絡(luò)方作為一種天然來源的PTGS2和EPHX2雙重抑制劑，可通過恢復花生四烯酸代謝平衡，減輕肺上皮細胞中的COPD相關(guān)鐵死亡。這些發(fā)現(xiàn)為系統(tǒng)解析復雜中藥復方的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制建立了方法學框架，同時也為開發(fā)新的雙靶點藥物提供了基礎(chǔ)。最終，研究將清肺通絡(luò)方及其關(guān)鍵成分定位為具有疾病修飾潛力的候選干預方案，為COPD相關(guān)治療策略提供了有益補充。

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