Phytomedicine (1區Top)｜藍桉果實提取物靶向IRE1α/XBP1s軸改善MASLD：活性成分MA首次鎖定IRE1α h1口袋！(孔令義...

2026年6月，中國藥科大學天然藥物全國重點實驗室/江蘇省活性天然產物研究重點實驗室、中藥學院孔令義、楊明華團隊等，在Phytomedicine（中科院1區Top，2024 Journal Impact Factor=8.3）發表題為 “Eucalyptus globulus fruit extract alleviates MASLD via modulation of the IRE1α/XBP1s pathway” 的研究論文。該文于2026年4月7日投稿，2026年5月20日修回，2026年6月2日接收，目前為 Journal Pre-proof 版本。

該研究聚焦藍桉果實提取物（EgE）在代謝功能障礙相關脂肪性肝病（MASLD）中的潛在干預作用。研究發現，EgE 不僅能在游離脂肪酸（FFA）誘導的肝細胞脂肪變性模型中顯著降低脂質積累，還能在高脂飲食（HFD）和蛋氨酸-膽堿缺乏飲食（MCD）誘導的兩種 MASLD 小鼠模型中改善糖脂代謝紊亂、減輕肝臟脂肪變性及相關病理性肝損傷。

機制上，研究者通過轉錄組學、DARTS、通路抑制/敲低實驗和分子對接等方法發現，EgE 可激活適應性 IRE1α/XBP1s 信號軸，進而調控肝臟糖異生、脂質生成和脂質分泌相關轉錄譜，并抑制病理性內質網應激。進一步研究鑒定出 Macrocarpal A（MA） 是 EgE 的主要活性成分，可結合 IRE1α 的 h1 口袋，增加 IRE1α 二聚體水平，上調 XBP1s，從而介導降脂作用。作者認為，MA 是首個被報道可結合 IRE1α h1 二聚化口袋的天然 IRE1α 激活劑，為 MASLD 的植物來源候選干預策略提供了新的實驗依據。

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【摘要】

背景：代謝功能障礙相關脂肪性肝病（MASLD）的發病率持續升高，但可用的藥物治療選擇仍然有限。藍桉（Eucalyptus globulus）果實是一種具有經驗性調脂作用的草藥，但其針對 MASLD 的治療潛力尚未得到系統研究。

目的：本研究旨在評估藍桉果實提取物（E. globulus fruit extract，EgE）抗 MASLD 的作用，鑒定其主要活性成分，并闡明潛在作用機制。

方法：研究首先在游離脂肪酸（free fatty acid，FFA）刺激的肝細胞中評價 EgE 的降脂活性，隨后在兩種 MASLD 小鼠模型中評估其治療作用。研究者進一步通過植物化學分析鑒定 EgE 的主要成分，并結合轉錄組學、藥物親和反應靶標穩定性實驗（drug affinity responsive target stability，DARTS）、通路抑制/敲低實驗、分子對接等方法探究其作用機制。

結果：EgE 可顯著降低 FFA 誘導的體外脂質含量升高。在體內實驗中，EgE 明顯改善糖脂代謝紊亂，減輕肝臟脂肪變性，并緩解相關病理性肝損傷。肝臟轉錄組分析顯示，脂質代謝和內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）相關通路顯著富集。進一步機制研究表明，EgE 是 IRE1α 調節劑，可激活適應性 IRE1α/XBP1s 信號，從而抑制病理性 ERS。Macrocarpal A（MA）被鑒定為主要活性成分。MA 可結合 IRE1α 的 h1 口袋，增加其二聚體形式，提高 XBP1s 水平，并發揮降脂作用。

結論：EgE 通過激活適應性 IRE1α/XBP1s 軸表現出顯著抗 MASLD 作用，具有作為 MASLD 管理新型候選藥物的潛力。其主要成分 MA 可直接作用于 IRE1α 的 h1 口袋并增加二聚體 IRE1α，這是一種此前未被認識到的結合模式。

01

研究背景及科學問題

代謝功能障礙相關脂肪性肝病（MASLD）主要由肝細胞脂質穩態失衡驅動。未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）是調控肝臟脂質代謝平衡的核心適應性信號通路。作為進化上最保守的跨膜 UPR 感受器，肌醇需求酶 1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）已成為代謝性肝病領域的重要研究靶點。IRE1α 可協調下游信號級聯，抑制異常肝脂質沉積，并維持正常脂蛋白分泌。因此，靶向調控 IRE1α 信號有望糾正肝臟脂質代謝紊亂并改善后續肝損傷，是 MASLD 治療中頗具潛力的策略。

IRE1α 具有雙重酶活性，既是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，也是一種內切核糖核酸酶（RNase）。IRE1α 激酶結構域發生反式自磷酸化后，可促進核苷酸與激酶口袋結合，從而推動 IRE1α 形成具有催化活性的背靠背二聚體構象，并進一步激活其 RNase 結構域。被激活的 IRE1α RNase 主要通過兩種經典下游機制調控細胞適應性穩態和命運決定：其一，對 XBP1 mRNA 進行位點特異性剪切，生成具有轉錄活性的剪接型異構體 XBP1s；其二，通過 IRE1 依賴性調控性降解（regulated IRE1-dependent decay，RIDD）選擇性降解含有 XBP1 樣莖環結構的 mRNA。

IRE1α/XBP1s 通路是抵御肝臟脂肪變性的關鍵適應性機制。肝臟特異性敲除 Xbp1 會導致全身代謝紊亂并促進肝脂肪變性；相反，在肥胖動物模型中過表達 XBP1s 可顯著緩解脂肪性肝病嚴重程度。XBP1s 能廣泛調節肝臟胰島素敏感性、脂質生成、脂肪酸氧化以及脂蛋白分泌，從而維持肝臟脂質穩態。

然而，當代謝應激超過 IRE1α/XBP1s 信號軸的適應能力時，持續性 ERS 會誘導 IRE1α 活性發生病理性轉變。在生理狀態下，基礎 RIDD 活性持續存在并發揮有益的穩態維持作用；但在病理狀態下，異常 RIDD 活性會超出其經典靶標范圍，廣泛降解編碼促存活因子以及特定 microRNA 前體的轉錄本，從而觸發促凋亡信號輸出，加重肝細胞損傷和肝功能障礙。值得注意的是，選擇性 IRE1α/XBP1s 激活劑 IXA4 的相關研究顯示，在不同時誘導 RIDD 或其他病理性 ERS 反應的情況下，靶向激活該通路可有效改善肥胖相關的全身脂質代謝紊亂。這提示藥理學調控 IRE1α/XBP1s 軸在 MASLD 治療中具有重要潛力。

藍桉（Eucalyptus globulus，桃金娘科）廣泛種植于中國西南地區。其果實俗稱“一口鐘”，長期用于傳統臨床實踐，被認為具有祛風除濕、清熱解毒、止咳平喘等作用。藥用時，藍桉果實通常以水煎、酒浸或外用方式使用。植物化學研究發現，藍桉果實的主要活性成分包括甲酰間苯三酚雜萜類化合物（formyl phloroglucinol meroterpenoids，FPMs）、黃酮類、三萜類和揮發油。其中，FPMs 是主要富集于桉屬植物中的特征性成分，并具有較強藥理活性。

隨著現代生活方式發生深刻變化，具有調脂能力的天然植物資源受到越來越多藥理學研究關注。已有研究提示，藍桉葉具有減重作用；在中國民間實踐中，藍桉果實也被用作降脂草本茶。來自哥倫比亞和秘魯的民族藥理學調查同樣支持藍桉果實具有經驗性調脂和抗糖尿病作用。然而，介導這些調脂作用的活性成分以及其分子機制仍不清楚。此外，藍桉果實針對 MASLD 的治療潛力尚未被系統探索。

本研究證明，EgE 可通過激活 IRE1α/XBP1s 通路，抑制肝臟糖異生和脂質生成關鍵基因表達，并促進肝細胞脂質外排，從而重塑肝臟脂質代謝并顯著改善 MASLD。值得關注的是，EgE 的主要活性成分 MA 可能與人源 IRE1α 的 h1 口袋結合，增加 IRE1α 二聚體形式，并進一步促進下游 XBP1 mRNA 剪接，改善脂質代謝。總體而言，本研究加深了對藍桉果實藥理作用的認識，并為開發 MASLD 新型治療候選物提供了基礎。

02

重要發現及亮點

EgE 減輕 FFA 誘導的肝細胞脂質積累

研究者首先在 AML12 和 HepG2 肝細胞中構建 FFA 誘導的肝脂肪變性細胞模型，用于評價 EgE 的降脂作用。CCK-8 結果顯示，EgE 濃度不超過 20 μg/mL 時，對兩種細胞均無明顯細胞毒性。隨后，研究者用 0.5 mM FFA 處理細胞 24 h 誘導脂肪變性，再給予 2.5、5 和 10 μg/mL EgE 干預 16 h，并以瑞舒伐他汀（rosuvastatin，Rsv）作為陽性對照。

BODIPY 493/503 染色顯示，EgE 可劑量依賴性減少細胞內脂滴積累。定量分析進一步表明，與僅 FFA 處理的模型組相比，10 μg/mL EgE 可使 HepG2 細胞脂質含量降低約 37%，使 AML12 細胞脂質含量降低約 28%。同時，EgE 還可劑量依賴性降低兩種細胞內總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平；在 10 μg/mL 時，EgE 使 HepG2 和 AML12 細胞內 TC 水平均降低超過 20%，TG 水平均降低超過 30%。這些結果說明，EgE 能有效緩解 FFA 誘導的肝細胞脂質積累。

圖1：EgE 減輕 FFA 暴露肝細胞中的脂肪變性。（A）采用 CCK-8 實驗檢測人 HepG2 細胞和小鼠 AML12 肝細胞在不同濃度 EgE 處理后的細胞活力。（B-C）FFA 誘導的 HepG2 和 AML12 細胞在有無 EgE 干預條件下的代表性 BODIPY 染色圖像（比例尺，200 μm）（B），以及 BODIPY 陽性脂滴面積的定量分析（C）。（D）FFA 誘導的 HepG2 和 AML12 細胞在有無 EgE 處理條件下的細胞內 TC 和 TG 含量。數據以 3 次獨立生物學重復的均值 ± SD 表示。## < 0.001，與對照組相比；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，與僅 FFA 處理組相比。

EgE 改善 HFD 誘導 MASLD 小鼠的脂質代謝紊亂

在進入療效評價前，研究者首先進行了 EgE 急性毒性評估。小鼠單次灌胃 200 mg/kg EgE 后，在 7 天觀察期內未出現死亡、行為異常或主要器官組織病理學改變。隨后，研究者采用高脂飲食（high-fat diet，HFD）喂養 C57BL/6 小鼠 8 周，建立 MASLD 模型。建模成功后，小鼠分別接受 10、20 或 40 mg/kg EgE 每日灌胃干預 4 周，并以臨床已批準的降脂中成藥血脂康（XZK）作為陽性對照。

HFD 組小鼠體重增長明顯高于普通飲食（ND）組，而 EgE 處理組終末體重與 HFD 對照組相近。但 EgE 和血脂康均顯著降低 HFD 誘導升高的絕對肝重和附睪白色脂肪組織（eWAT）質量，且 EgE 的作用具有劑量依賴性。40 mg/kg EgE 組的肝重/體重比相比 HFD 組下降約 26%。

血清生化結果顯示，EgE 可劑量依賴性改善 HFD 誘導的高甘油三酯血癥和高膽固醇血癥。40 mg/kg EgE 可使血清 TC 和 TG 部分恢復至接近 ND 組水平，其作用較血脂康組更明顯。EgE 還可劑量依賴性降低血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）并升高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。在肝損傷方面，HFD 顯著升高血清 ALT 和 AST 水平，而 EgE 可劑量依賴性減輕這一升高，提示其對 HFD 誘導的肝損傷具有保護作用。

此外，EgE 還能改善葡萄糖穩態。4 周 EgE 給藥可劑量依賴性降低空腹血糖；口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）顯示，EgE 組全身葡萄糖清除能力明顯改善。40 mg/kg EgE 組 OGTT 曲線下面積（AUC）較 HFD 組降低約 25%，且效果優于血脂康組，提示胰島素敏感性可能得到改善。

肝臟層面的檢測進一步支持 EgE 的保護作用。EgE 顯著降低肝臟 TC 和 TG 水平，其中 40 mg/kg EgE 可使肝臟 TG 含量較 HFD 對照組降低約 40%。油紅 O 染色顯示，EgE 處理后肝臟脂滴積累呈劑量依賴性減少；H&E 染色也顯示，EgE 明顯緩解 HFD 誘導的嚴重脂肪變性。40 mg/kg EgE 組肝細胞空泡化減少最為明顯，效果顯著優于血脂康組。qRT-PCR 分析還顯示，EgE 可劑量依賴性下調肝臟促炎細胞因子 Tnf-α、Il-6 和 Il-1β 的 mRNA 表達。

總體來看，EgE 能有效減輕肝臟脂肪變性，減少后續組織病理性肝損傷和伴隨的肝臟炎癥反應，從而阻礙 MASLD 進展。

圖2：EgE 減輕 HFD 誘導 MASLD 小鼠的肝脂肪變性（每組 n = 6 只小鼠）。（A）HFD 誘導 MASLD 小鼠中 EgE 灌胃給藥方案示意圖。（B）各組小鼠肝指數（肝重/體重比）和附睪脂肪指數。（C）血清 TC 和 TG 水平。（D）血清 AST 和 ALT 水平，用于反映肝細胞損傷程度。（E-F）空腹血糖（E）和口服葡萄糖耐量試驗（F），用于評估葡萄糖穩態和全身葡萄糖清除能力。（G）肝臟 TG 和 TC 水平，用于反映肝內脂質積累。（H-I）小鼠肝臟代表性大體圖像以及典型肝組織切片染色圖像，包括油紅 O 染色（比例尺，500 μm）和 H&E 染色（比例尺，250 μm）（H），以及對應的肝臟脂肪空泡面積和油紅 O 陽性脂滴面積定量分析（I），證實 EgE 可劑量依賴性減輕肝脂肪變性。數據以均值 ± SD 表示。## < 0.001，與對照組相比；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，與 HFD 組相比。

EgE 改善 MCD 飲食誘導的 MASLD 小鼠肝臟病變

為進一步評價 EgE 對更進展階段 MASLD 的干預潛力，研究者采用蛋氨酸-膽堿缺乏飲食（methionine-choline deficient diet，MCD）建立小鼠模型。雄性 C57BL/6 小鼠經 MCD 飲食喂養 4 周后，接受 20 或 40 mg/kg/day EgE 每日灌胃干預 4 周，并以 20 mg/kg/day 奧貝膽酸（obeticholic acid，OCA）作為陽性對照。

EgE 可劑量依賴性減輕 MCD 飲食誘導的體重下降，并顯著降低升高的肝臟重量，提示其對系統代謝穩態具有一定改善作用。肝臟脂質分析顯示，40 mg/kg/day EgE 可使肝臟 TG 含量降低 43.8 ± 7.1%，降幅較 OCA 的 29.8 ± 10.8% 更明顯。值得注意的是，EgE 和 OCA 對肝臟 TC 水平均僅表現出輕度抑制作用。

MCD 飲食導致血清 TC 和 TG 濃度明顯下降，反映肝臟脂質分泌和輸出受損；EgE 則可劑量依賴性恢復這些循環脂質參數。同時，EgE 顯著降低血清 ALT 和 AST 水平，效果與 OCA 相當，并在數值上略優于 OCA，提示其可有效保護肝臟免受損傷。此外，MCD 飲食顯著削弱肝臟抗氧化能力，表現為血清 SOD 活性降低、MDA 含量升高；EgE 可劑量依賴性逆轉這些改變，提高 SOD 活性并降低 MDA 水平。

組織病理學和分子分析進一步驗證了 EgE 的肝臟保護作用。H&E 和油紅 O 染色顯示，EgE 可劑量依賴性減輕肝臟脂質空泡化和脂肪變性。Masson 三色染色和 Sirius Red 染色進一步顯示，EgE 顯著減少膠原沉積并延緩肝纖維化進展。基于 NAFLD 活動評分（NAS）的定量分析顯示，相同劑量下 EgE 所達到的病理改善程度與 OCA 相當。qRT-PCR 結果顯示，與 MCD 對照組相比，EgE 明顯抑制肝臟促炎基因 Tnf-α、Adgre1、Ccl2 以及促纖維化基因 Acta2、Col1a1、Cxcl10、Tgfb1 的 mRNA 表達。

結合 HFD 模型結果可見，EgE 在不同誘導方式的 MASLD 小鼠模型中均表現出顯著干預作用。

圖3：EgE 改善 MCD 誘導 MASLD 小鼠的肝脂肪變性、炎癥和纖維化（每組 n = 6 只小鼠）。（A）MCD 飲食誘導 MASLD 小鼠中 EgE 灌胃給藥方案示意圖。（B）各組小鼠體重和肝重。（C）肝臟 TG 和 TC 含量，用于反映肝內脂質積累。（D）血清 ALT 和 AST 水平，用于反映肝細胞損傷程度。（E-F）小鼠肝臟代表性大體圖像和組織學染色圖像（E），包括 H&E 染色（比例尺，250 μm）、油紅 O 染色、Masson 三色染色（比例尺，500 μm）和 Sirius Red 染色（比例尺，100 μm），以及對應的定量分析（F），驗證 EgE 可劑量依賴性改善肝脂肪變性、炎癥浸潤和肝纖維化。數據以均值 ± SD 表示。## < 0.001，與 MCS 組相比；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，與 MCD 組相比。

轉錄組分析提示 EgE 通過調控肝臟脂質代謝和 ERS 改善 MASLD

為闡明 EgE 改善 MASLD 的分子機制，研究者對 ND、HFD 和 HFD+EgE-40 組小鼠肝組織進行了 RNA-seq 分析。主成分分析（PCA）顯示，三組樣本在轉錄組水平上明顯分離，前兩個主成分累計解釋超過 60% 的方差。采用嚴格篩選標準后，研究者在 EgE-40 組與 HFD 組之間鑒定出 904 個差異表達基因，其中 581 個上調、323 個下調。

KEGG 通路富集分析顯示，這些差異基因顯著富集于“視黃醇代謝”“亞油酸代謝”“類固醇激素生物合成”和“內質網蛋白加工”等通路。GO 富集分析也顯示，細胞組分“內質網”和生物過程“細胞脂質代謝過程”明顯富集。進一步采用 GSEA 分析 KEGG 和 Hallmark 基因集，結果與 KEGG 和 GO 富集高度一致。因此，后續研究重點驗證了脂質代謝和 ERS 通路。

脂質代謝相關基因熱圖顯示，與 ND 組相比，HFD 組上調脂質生成關鍵基因 Mvd、Dgat2、Acaca 和 Fasn，同時下調脂解相關基因 Ppargc1b、Acox1、Pparα 和 Cpt1a；EgE-40 則逆轉了這些異常表達模式。qRT-PCR 和 Western blot 進一步驗證，EgE-40 顯著降低脂質生成基因 Acaca、Fasn、Dgat2 的 mRNA 水平，并升高脂解基因 Cpt1a 和 Pparα 的 mRNA 水平。在蛋白水平上，EgE-40 劑量依賴性抑制脂肪酸合酶（FASN）和核型固醇調節元件結合蛋白 1（nSREBP1），同時升高肉堿棕櫚酰轉移酶 1a（CPT1a）水平。

探索性 KEGG 通路分析還顯示半乳糖代謝輕度富集。其中，參與肝臟糖異生的關鍵基因 G6pc 明顯下調，并經 qPCR 驗證。該糖異生抑制作用可能是 EgE 改善全身葡萄糖穩態的重要原因之一。

考慮到 ERS 在 MASLD 發生發展中的關鍵作用，研究者進一步分析“內質網蛋白加工”通路中相關基因的表達模式。GSEA 顯示，EgE 顯著逆轉了 HFD 誘導的 ERS 相關基因集上調。相應熱圖也顯示，核心 ERS 相關基因整體下調。EgE 明顯降低關鍵內質網伴侶蛋白 Hspa5（編碼 GRP78）及其促凋亡下游效應分子 Ddit3（編碼 CHOP）的 mRNA 和蛋白水平；在 MCD 飲食誘導模型中，同樣觀察到 GRP78 和 CHOP 被抑制。此外，EgE 在兩種模型中均削弱三條經典 ERS 感受器通路的激活/表達，包括 p-IRE1α、p-PERK 和 ATF6。

這些結果表明，EgE 通過協同調控糖脂代謝并減輕 ERS，改善肝臟脂質積累，為其抗 MASLD 作用提供了關鍵機制依據。

圖4：轉錄組分析揭示 EgE 改善 HFD 誘導 MASLD 小鼠的潛在機制（每組 n = 4）。（A）ND、HFD 和 EgE-40 組 RNA-seq 數據的 PCA 圖。（B）EgE-40 組與 HFD 組之間差異表達基因（DEGs）的 KEGG 通路富集分析。（C）差異表達基因的 GO 功能富集分析。（D）基于 RNA-seq 數據的脂質代謝相關基因表達譜熱圖，并結合 RT-qPCR 和 Western blot（WB）檢測關鍵脂質合成基因（Acaca、Fasn 和 Dgat2）以及脂質降解基因（Cpt1a 和 Pparα）的相對 mRNA 和蛋白水平。（E）EgE-40 組與 HFD 組之間內質網蛋白加工通路的 GSEA 分析。（F）基于 RNA-seq 數據的 ERS 相關基因表達譜熱圖，并結合 RT-qPCR 和 WB 檢測 HFD、EgE-10、EgE-20 和 EgE-40 組中 Hspa5 和 Ddit3 的相對 mRNA 水平及其對應蛋白 GRP78 和 CHOP 的水平。（G）WB 驗證 MCD 飲食誘導 MASLD 小鼠肝臟中 GRP78 和 CHOP 蛋白表達。（H）WB 分析 HFD 誘導及 EgE 處理組中三種經典 ERS 感受器蛋白水平，包括 pIRE1α S724、pPERK T980 和 ATF6。## < 0.001，與對照組相比；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，與 HFD 組相比。

EgE 主要成分鑒定及體外降脂活性篩選

研究者采用色譜和波譜相結合的方法，從 EgE 中分離并鑒定出 8 種雜萜類成分。這些成分在藍桉果實水煎液中也可檢測到，但含量相對較低。通過將 1H NMR 和 13C NMR 數據與文獻報道進行比較，研究者將其鑒定為 Macrocarpal A（MA）、Macrocarpal E（ME）、Macrocarpal B（MB）、Macrocarpal D（MD）、Macrocarpal L（ML）、Macrocarpal M（MM）、Macrocarpal O（MO）和 Macrocarpal Q（MQ）。

隨后，研究者使用相應對照品建立 HPLC 定量方法，并對主要成分進行檢測。方法學驗證顯示，8 種雜萜類化合物均具有良好線性關系，相關系數 r2 > 0.99；精密度、重復性和穩定性的相對標準偏差均小于 2.5%。10 批 EgE 的 HPLC 指紋圖譜具有高度一致性，樣品相似度均大于 0.99，提示藥材批間一致性較好。定量分析顯示，MA 是 EgE 中含量最高的成分，含量為 24.62 mg/g。

為評價這 8 種雜萜類成分的降脂作用，研究者在 FFA 誘導的 HepG2 細胞中檢測細胞內 TG 含量。結果顯示，8 種成分均可抑制 FFA 誘導的脂質積累，抑制率為 10.2%–47.5%。其中 MA 活性最強，可使細胞內 TG 含量降低 47.5 ± 6.6%。油紅 O 染色進一步支持該結果。BODIPY 熒光染色顯示，MA 的降脂作用呈劑量依賴性，且在相同劑量下作用與 Rsv 相當。因此，MA 被確定為 EgE 的主要降脂活性成分。

圖5：主要成分的植物化學分析及體外降脂篩選。（A）EgE 中化學成分的代表性 HPLC 色譜圖。（B）通過 NMR 鑒定的 8 種成分化學結構。（C）10 批 EgE 的代表性 HPLC 指紋圖譜（相似度 > 0.9）。（D-E）FFA 刺激 HepG2 細胞后，在有無單一成分（10 μM）處理條件下的 TG 定量檢測結果（D）和代表性油紅 O 染色圖像（比例尺，50 μm）（E）。（F）FFA 誘導 HepG2 細胞在有無 MA 干預（2.5–10 μM）條件下的代表性 BODIPY 染色圖像（比例尺，200 μm）。## < 0.001，與對照組相比；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，與僅 FFA 處理組相比。

EgE 通過激活 IRE1α/XBP1s 通路減輕肝細胞脂質積累

為尋找 EgE 的蛋白靶點，研究者整合了計算靶點預測、疾病相關基因挖掘和實驗靶點驗證三種策略。首先，通過 SuperPred 3.0 和 PharmMapper 在線平臺預測 8 種成分的潛在靶點，共獲得 383 個高置信候選蛋白靶點。其次，系統挖掘 GeneCards 數據庫中與 MASLD 相關的基因，獲得 998 個相關性評分高于中位數的蛋白編碼基因。第三，研究者開展 DARTS 實驗，并對差異蛋白條帶進行質譜蛋白組學分析，鑒定出 1110 個候選結合蛋白。三類靶點列表整合后，最終匯聚出 5 個高優先級候選蛋白。

在所有候選靶點中，IRE1α 在篩選策略中排名最高，其最高評分來自質譜分析。CETSA 結果顯示，EgE 可在熱應激條件下顯著增加 IRE1α 的熱穩定性。DARTS 結合免疫印跡實驗進一步顯示，EgE 可濃度依賴性增強 IRE1α 穩定性。由于 XBP1s 是 IRE1α RNase 活性的直接功能讀出，研究者進一步檢測 XBP1 mRNA 剪接。結果顯示，EgE 在 HepG2 細胞中劑量依賴性促進 XBP1 mRNA 剪接，但并不改變 IRE1α 的 mRNA 或蛋白表達水平。

當研究者加入選擇性 XBP1s 抑制劑 4μ8c 后，EgE 誘導的 XBP1s 轉錄變化被明顯逆轉。下游 UPR 靶基因的轉錄組分析進一步提示，EgE 對 IRE1/XBP1 信號通路具有優先調節作用。動物模型中，EgE 給藥同樣顯著提高 HFD 和 MCD 飲食誘導 MASLD 小鼠肝臟核內 XBP1s 蛋白水平。

為了驗證 IRE1α/XBP1s 通路是否參與 EgE 的抗 MASLD 作用，研究者在 FFA 誘導的脂肪變性細胞模型中使用選擇性 IRE1α/XBP1s 激活劑 IXA4 和抑制劑 4μ8c。IXA4 被證實可改善脂質積累；而 4μ8c 與 EgE 共處理可顯著削弱 EgE 降低 HepG2 和 AML12 細胞內脂滴積累的作用。進一步的轉錄檢測顯示，在 FFA 誘導的 HepG2 脂肪變性模型中，EgE 顯著抑制糖異生關鍵基因 G6PC、PCK1 以及脂質生成基因 SREBF1C、DGAT2 的表達；而 4μ8c 幾乎消除了 EgE 對脂質轉運相關基因 PDIA4 和 SEC24D 的上調作用。

這些結果表明，EgE 可通過激活 IRE1α/XBP1s 通路，減輕 MASLD 中的肝臟脂質積累。

圖6：EgE 通過激活 IRE1α/XBP1s 通路減輕肝臟脂質積累。（A-B）DARTS 實驗流程示意圖（A），以及經考馬斯亮藍染色 SDS-PAGE 凝膠可視化的代表性 DARTS 實驗結果（B）。（C）維恩圖展示通過整合篩選策略識別出的 EgE 潛在靶蛋白交集，該策略包括計算靶點預測（SuperPred、PharmMapper）、MASLD 相關基因挖掘（GeneCards）以及 DARTS 實驗靶點驗證。（D）基于整合篩選策略得到的前 5 個高優先級候選蛋白。（E-F）通過 CETSA（E）以及 DARTS 結合免疫印跡（F）驗證 IRE1α 是 EgE 的潛在靶點。（G）代表性 cDNA 凝膠圖像顯示，EgE（0–10 μg/mL）在 HepG2 細胞中濃度依賴性誘導 XBP1 mRNA 剪接。（H-I）EgE 驅動的 IRE1α/XBP1s 激活介導肝細胞降脂作用。（H）采用 RT-qPCR 檢測 HepG2 細胞經 EgE 和/或選擇性 IRE1α RNase 抑制劑 4μ8c（10 μM）處理后的 XBP1s mRNA 水平。（I）HepG2 細胞脂滴的代表性 BODIPY 染色圖像，顯示 4μ8c（10 μM）共處理可消除 EgE 的降脂作用。比例尺，20 μm。（J-K）EgE 驅動的 XBP1s 激活調控糖脂代謝基因轉錄。（J）采用 WB 檢測有無 EgE 處理小鼠的肝臟 XBP1s 蛋白表達。（K）采用 RT-qPCR 檢測 HepG2 細胞經 EgE（10 μg/mL）和/或 4μ8c（10 μM）處理后，糖異生基因（G6PC1、PCK1）、脂質生成基因（SREBF1c、DGAT2）和脂質轉運基因（PDIA4、SEC24D）的 mRNA 水平。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

主要活性成分 MA 結合 IRE1α 的 h1 口袋并提高其二聚體水平

在 EgE 的 8 種成分中，MA 含量最高且降脂活性最強，因此研究者選擇 MA 進行進一步機制研究。CETSA 結果驗證了 MA 與 IRE1α 的潛在相互作用。隨后，研究者使用無細胞熒光探針實驗，定量檢測 MA 對重組 IRE1α RNase 活性的影響。結果顯示，無論是否存在 ADP，MA 均可顯著增強 IRE1α RNase 活性。值得注意的是，過量 ADP 并不能競爭性阻斷 MA 驅動的 IRE1α 激活，反而表現出協同作用，提示 MA 并不占據經典核苷酸結合口袋。Western blot 檢測還顯示，MA 干預 2–12 h 內并未上調 Ser724 位點的 IRE1α 磷酸化水平。

由于二聚化對于 IRE1α RNase 活性不可或缺，研究者進一步對 IRE1α 二聚化界面上已知配體結合口袋進行計算對接分析。含關鍵殘基 H692 的口袋是促進 IRE1α 二聚化的結合位點，但 MA 在該口袋中未能形成穩定結合模式。相反，MA 與 IRE1α h1 口袋對接時顯示出較高親和力，結合能為 ?7.2 kcal/mol，并與 Tyr960(B)、Arg955(B) 和 Gln840(A) 形成氫鍵相互作用。分子動力學模擬進一步驗證了 MA-IRE1α 二聚體復合物的穩定性，表現為整體骨架 RMSD 較低、小于 2.5 ?，關鍵結合殘基 RMSF 較低、小于 4 ?，且回轉半徑 Rg 較低、小于 30 ?。這些計算結果提示，h1 位點可能是 MA 作用于 IRE1α 的功能性結合口袋。

為進一步實驗驗證 MA 與 h1 口袋的相互作用，研究者首先進行計算機丙氨酸掃描，預測可能參與 MA 結合的關鍵殘基。結果顯示，每個突變均顯著提高計算結合自由能。隨后，研究者在 HEK293T 細胞中轉染編碼野生型 IRE1α（WT）或三突變體 IRE1α（MUT；Y960A/R955A/Q840A）的質粒。化學交聯結合 Western blot 顯示，IRE1α-MUT 的基礎二聚化未發生改變，但在 IRE1α-WT 中觀察到的 MA 誘導 IRE1α 二聚體增加，在突變體中大部分消失。CETSA 結果也顯示，MA 可顯著穩定 WT-IRE1α，但對三突變體沒有明顯熱穩定作用。

這些發現表明，h1 口袋中的 Tyr960(B)、Arg955(B) 和 Gln840(A) 對 MA 介導的 IRE1α 二聚體水平升高具有關鍵作用。

圖7：MA 結合 h1 口袋并增加 IRE1α 二聚體形式。（A）CETSA 驗證 MA 與 IRE1α 之間的潛在相互作用。（B）在僅有 IRE1α 或存在腺苷二磷酸（ADP，1 mM）、MA（10 μM）或 ADP+MA 條件下，IRE1α 介導底物剪切的時間進程熒光曲線。（C）MA-IRE1α 結合模式的分子對接。（D-F）通過分子動力學模擬評估 MA-IRE1α 復合物的結構穩定性。（D）均方根偏差（RMSD）；（E）回轉半徑（Rg）；（F）均方根波動（RMSF）。（G）丙氨酸掃描分析，將目標氨基酸殘基定點突變為丙氨酸后 MA-IRE1α 結合親和力的變化。（H-I）h1 口袋殘基在 MA 介導 IRE1α 結合和二聚化中的關鍵作用。（H）MA 對 HEK293T 細胞中野生型 IRE1α（IRE1α-WT）和突變型 IRE1α（IRE1α-MUT）二聚化的影響。（I）在過表達 IRE1α-WT 或定點突變 IRE1α 的 HEK293T 細胞中，采用 CETSA 分析 MA-IRE1α 相互作用。

MA 通過激活 IRE1α/XBP1s 通路調節糖脂代謝，且不誘導過度病理性 RIDD 活性

前述結果顯示，MA 可通過增加 IRE1α 二聚化促進 XBP1s 剪接。基于 EgE 通過該通路改善糖脂代謝并發揮降脂作用的觀察，研究者進一步驗證 MA 是否也依賴 IRE1α/XBP1s 信號軸減輕肝臟脂質積累。

在 FFA 誘導的 HepG2 脂肪變性模型中，MA 劑量依賴性促進 XBP1 mRNA 剪接；4μ8c 幾乎完全阻斷了 MA 誘導的 XBP1s mRNA 上調。隨后，研究者采用 siRNA 介導 IRE1α 敲低。si-IRE1α 可有效抑制 IRE1α 的 mRNA 和蛋白表達，并伴隨剪接型活性異構體 XBP1s 降低。在基礎狀態下，即沒有 FFA 誘導的脂毒性應激或 MA 處理時，IRE1α 敲低并未顯著影響 SREBF1c 表達或細胞內 TG 含量，提示 IRE1α 并不參與基礎脂質生成的構成性調控，而是在特定應激背景下調節脂質代謝。

相反，在 FFA 誘導背景下，IRE1α 敲低顯著升高糖異生基因 G6PC 和 PCK1 的表達，并幾乎消除 MA 對這些基因的抑制作用。與此同時，MA 可顯著上調對照肝細胞中 PDIA4 和 SEC24D 的表達，并減少 ApoB 細胞內滯留；但 IRE1α 敲低明顯削弱 MA 對 PDIA4、Sec24D 和 ApoB 的調控作用。MA 還可促進對照 siRNA 轉染細胞的 TG 分泌，而 IRE1α 敲低幾乎完全消除了這一促進作用。

這些結果通過藥理學抑制和遺傳學沉默兩種互補策略證明，MA 通過 IRE1α/XBP1s 依賴性方式調節糖脂代謝，從而減輕肝臟脂質積累。

與此同時，研究者還關注 MA 激活 IRE1α/XBP1s 通路時是否會誘發不良下游輸出。IRE1α 二聚化程度會直接決定其 RNase 活性。分子膠化合物維替泊芬（verteporfin，VP）在體外與重組 IRE1α 蛋白孵育時，可明顯促進 IRE1α 二聚化；而在相同條件下，MA 處理組 IRE1α 二聚體條帶強度僅輕度增加。細胞實驗也顯示，VP 處理組 IRE1α 二聚體水平明顯高于 MA 處理組；VP 組二聚體/單體比值為 1.9 倍，而 MA 組為 0.9 倍。

適度激活 IRE1α RNase 主要通過 XBP1s 介導適應性反應；但 RNase 過度激活會觸發過度 RIDD 和 JNK 依賴性凋亡等不適應性效應。因此，研究者以 VP 為對照，評估 MA 是否誘導不良反應。在 HepG2 細胞中，VP 處理 4 h 誘導的 XBP1 剪接顯著強于 MA，并觸發 RIDD 靶基因 SCARA3、HGSNAT 和 PPP2R1A 降解；而 MA 僅促進 XBP1 剪接。處理 12 h 后，VP 進一步使 XBP1s 蛋白升高至約為 MA 組的 2 倍，并強烈下調 RIDD 相關基因，其中 PPP2R1A mRNA 較對照降低約 5 倍；相比之下，MA 僅使這些 RIDD 靶標出現輕度、無統計學意義的降低。

結合 MA 的藥代動力學特征，研究者進一步分析 MA 處理后 IRE1α 信號通路的時間表達模式。在普通飼料喂養小鼠中，單次口服 10 mg/kg MA 后，肝臟 Xbp1s mRNA 在 4 h 顯著升高，8 h 開始下降，24 h 恢復至基線。經典 XBP1s 靶基因 Dnajb9 表現出相似變化。值得注意的是，RIDD 靶基因在所有時間點均未相對溶媒組發生改變。此外，EgE 也未觸發 IRE1α RNase 活性的有害下游輸出，如過度 RIDD 加工和 JNK 信號高激活。F4/80 免疫組化染色進一步證實，持續 EgE 干預可減輕肝臟巨噬細胞浸潤并減少肝細胞凋亡。

這些結果說明，長期 MA 處理并不會誘發 IRE1α 信號通路的有害脫靶激活。

圖8：IRE1α/XBP1s 通路介導 MA 對 MASLD 的改善作用，且不誘導過度病理性 RIDD 活性。（A）代表性 cDNA 凝膠圖像顯示，MA（0.2–5 μM）在 HepG2 細胞中濃度依賴性誘導 XBP1 mRNA 剪接。（B）在暴露于 MA（5 μM）和/或選擇性抑制劑 4μ8c（10 μM）的 HepG2 細胞中，采用 RT-qPCR 評價 MA 對 XBP1s 激活的 IRE1α 依賴性。（C-D）HepG2 細胞轉染非沉默對照 siRNA 或 IRE1α 靶向 siRNA 后，經溶媒或 MA（10 μM）預處理，分別采用 RT-qPCR 和 WB 檢測 IRE1α 與 XBP1s 的 mRNA（C）和蛋白（D）表達。（E）按（C-D）所述方式處理 HepG2 細胞后，檢測糖異生基因（G6PC、PCK1）和脂質轉運基因（PDIA4、SEC24D）的 mRNA 水平。（F-G）按（C-D）所述方式處理 HepG2 細胞后，采用 WB 分析 ApoB100、PDI 和 MTTP 蛋白表達（F），并定量檢測分泌性 TG（G）。（H-I）不同處理條件下 IRE1α 二聚化水平比較：（H）重組 IRE1α 蛋白與溶媒、10 μM MA 或 10 μM VP 孵育 30 min 后進行體外化學交聯實驗；（I）WB 分析 HepG2 細胞經 10 μM MA 或 10 μM VP 處理后的細胞內 IRE1α 二聚化。（J）采用 RT-qPCR 分析 HepG2 細胞經溶媒、MA（10 μM）和/或 VP（10 μM）處理 4 h 或 12 h 后，XBP1s、其靶基因 DNAJB9 以及 RIDD 相關基因（BLOC1S1、SCARA3、HGSNAT、PPP2R1A）的 mRNA 水平，從而確定 MA 和 VP 對 IRE1α-RNase 下游信號的不同激活模式。（K）普通飼料喂養小鼠單次口服 MA（10 mg/kg）后 4、8 和 24 h，采用 RT-qPCR 分析肝臟 Xbp1s、其靶基因 Dnajb9 以及 RIDD 相關基因（Scara3、Ppp2r1a）的 mRNA 水平，從而表征 MA 對肝臟 IRE1α 下游信號的適應性激活特征。每組 n = 4 只小鼠。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001（雙因素 ANOVA）。

【貢獻】★★★★★

本研究表明，EgE 可通過激活 IRE1α/XBP1s 信號軸，糾正肝臟糖脂代謝紊亂，從而在 HFD 和 MCD 誘導的 MASLD 小鼠模型中改善疾病表型。其主要成分 MA 是首個經驗證能夠結合 IRE1α h1 口袋的配體。這些發現強調了激活 IRE1α/XBP1s 軸在不同病理背景 MASLD 中的治療潛力，也提示藍桉果實提取物有望成為 MASLD 干預的植物來源候選物。

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