曝光！WB 圖被查出拼接、手繪、復(fù)制條帶，修圖合規(guī)已成發(fā)表硬門檻

Western blot（WB）是生命科學(xué)蛋白定量檢測的核心主流手段，近幾年隨著期刊對圖像規(guī)范的要求不斷細(xì)化，如何做好 WB 圖像的記錄與處理，成為很多科研人員在投稿過程中需要認(rèn)真對待的環(huán)節(jié)。

2022 年美國癌癥研究協(xié)會(huì)（AACR）對 1,367 篇論文的研究顯示，約 40.8% 的論文圖像問題都出在 WB 條帶上。這一數(shù)字提示我們，不少問題可能并非源于主觀造假，而是對規(guī)范不夠熟悉所致。

圖 1 被撤稿論文里，不同類型圖像問題的分布

比如一篇結(jié)直腸癌相關(guān)論文陷入長期圖像爭議：該文刊發(fā)于《Cell Death & Disease》，曾被指出文章圖 6G 多條 WB 條帶高度重合，圖像查重比對后可疑痕跡清晰可見；作者隨后說明兩組條帶來自不同轉(zhuǎn)印膜，相似僅為實(shí)驗(yàn)條件所致，并公開全套原始未裁剪膜圖。

圖 2 β-TrCP 和 IGG 條帶與垂直拉伸后 P53R 顯示的條帶異常相似

另有一篇《Nature Aging》論文，其補(bǔ)充材料的 WB 圖中存在明顯拼接痕跡以及條帶復(fù)用、局部修圖等問題。

圖 3 受到爭議的 WB 條帶

從這些案例中可以看到，WB 圖像問題大致分為兩類：直觀可見的裁剪、復(fù)制泳道，以及隱蔽性更強(qiáng)的分區(qū)調(diào)色、無標(biāo)注拼接條帶。

了解期刊的具體要求，是避免無意間留下疑似篡改痕跡的第一步。基于這一行業(yè)背景，本文系統(tǒng)整理 WB 圖像存檔、定量歸一化、論文作圖全套標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)操規(guī)范，幫助正在投稿的科研人避坑。

WB 修圖：哪些操作期刊會(huì)重點(diǎn)關(guān)注

期刊和 AI 篩查系統(tǒng)通常會(huì)重點(diǎn)核查以下幾類操作，這些行為無論是否有意，都容易引發(fā)質(zhì)疑：

六大查重高危行為

選擇性裁剪泳道：刪掉陰性、無差異條帶，只留存支撐實(shí)驗(yàn)結(jié)論的條帶；

克隆復(fù)刻條帶：復(fù)制局部泳道、條帶片段，偽造獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)樣本；

分區(qū)調(diào)色造假：局部單獨(dú)調(diào)亮度對比度，人為拉大 / 縮小組間蛋白表達(dá)差值；

修圖掩蓋瑕疵：用修復(fù)、克隆畫筆去除雜帶、膜片污漬，隱藏實(shí)驗(yàn)原始缺陷；

無標(biāo)注跨膜拼接：混用不同凝膠、不同曝光時(shí)長泳道，不加分割線、不圖注說明；

形變規(guī)避查重：旋轉(zhuǎn)、拉伸、翻轉(zhuǎn)條帶，改動(dòng)原始成像形態(tài)躲避圖像比對。

相比之下，期刊通常允許的操作范圍相對明確：對整張膜統(tǒng)一微調(diào)亮度或?qū)Ρ榷龋⒃趫D注中注明調(diào)整參數(shù)，這屬于正常的圖像優(yōu)化。需要注意的是，用于論文中展示的美化圖片和用于計(jì)算定量數(shù)值的原始圖像應(yīng)當(dāng)分開，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)必須基于未經(jīng)任何修改的原始圖像。

原始文件的保存：投稿前提前整理好

期刊、合作者或同行有時(shí)會(huì)要求提供原始數(shù)據(jù)，提前整理好以下三類文件，會(huì)讓這個(gè)過程順暢很多：

第一類：無損原始文件，成像儀直出、零編輯 TIFF 原圖，不可壓縮、不可調(diào)色；

第二類：投稿定稿圖片，所有修改操作全程留痕，標(biāo)注完整處理步驟；

第三類：成像元數(shù)據(jù)表格，記錄曝光、硬件全部參數(shù)，佐證實(shí)驗(yàn)條件統(tǒng)一可控。

換一種 WB 定量方式，或可規(guī)避這類風(fēng)險(xiǎn)

最后，即便有了細(xì)致的記錄和透明的圖像處理，蛋白質(zhì)印跡數(shù)據(jù)的可靠性最終仍取決于這些圖像如何被定量和解讀。因此，歸一化是圖像完整性的關(guān)鍵延伸，可確保所觀察到的差異反映的是生物學(xué)現(xiàn)象，而非上樣或分析中的變異。

實(shí)踐中，這種傳統(tǒng)上通過光密度分析實(shí)現(xiàn)，即將條帶強(qiáng)度歸一化到單一上樣對照，通常是 GAPDH 或肌動(dòng)蛋白（actin）等管家蛋白。這種方法至今仍被廣泛使用，但存在公認(rèn)的局限。單一對照歸一化假定上樣對照蛋白在各實(shí)驗(yàn)條件下保持不變，且各泳道的總蛋白上樣量一致。這些假定在每個(gè)實(shí)驗(yàn)體系中都需要加以驗(yàn)證。

而總蛋白歸一化與總蛋白上樣量（Stain-Free 及相關(guān)方法）一種替代的歸一化方法是通過 Stain-Free 技術(shù)（例如 Bio-Rad Stain-Free 凝膠）或如 Ponceau S 這類可逆染色法進(jìn)行總蛋白檢測。Stain-Free 技術(shù)利用蛋白質(zhì)中色氨酸殘基在紫外激活下的固有熒光，無需額外染色即可檢測和定量每個(gè)泳道的總蛋白，優(yōu)勢包括：

歸一化到總蛋白，而非單一對照

檢測單一管家蛋白可能遺漏的潛在上樣不一致

減少膜剝離和重新探測的步驟

近期證據(jù)支持總蛋白歸一化具有更高的可重復(fù)性。一項(xiàng)比較各歸一化方法的分析[1]發(fā)現(xiàn)，與肌動(dòng)蛋白或 β-微管蛋白歸一化相比，Stain-Free 歸一化降低了變異性，并將達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性所需的樣本量減少了 50% 以上。

在發(fā)表方面，《生物化學(xué)雜志》（Journal of Biological Chemistry）推薦歸一化到總蛋白，但強(qiáng)調(diào)只有在研究者已證明管家蛋白的表達(dá)不受實(shí)驗(yàn)處理影響時(shí)，才可使用管家蛋白。最嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖龇ㄊ窃谘a(bǔ)充數(shù)據(jù)中同時(shí)報(bào)告總蛋白歸一化值和管家蛋白歸一化值，使讀者能夠評估結(jié)論的穩(wěn)健性。

圖 4 Stain-Free 技術(shù)在寬廣的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)提供總蛋白與信號(hào)之間的 1:1 對應(yīng)關(guān)系。A，Stain-Free 總蛋白信號(hào)；B，β-肌動(dòng)蛋白信號(hào)；C，β-微管蛋白信號(hào)；D，GAPDH 信號(hào)；E，在一系列蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)總蛋白歸一化與管家蛋白歸一化線性度的比較。

專業(yè)成像設(shè)備加持，筑牢數(shù)據(jù)合規(guī)防線

除了優(yōu)選總蛋白歸一化方法，專業(yè)成像設(shè)備也能為 WB 實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)合規(guī)與精準(zhǔn)定量全面保駕護(hù)航。

Bio-Rad 的 ChemiDoc MP 成像系統(tǒng)兼具高性能化學(xué)發(fā)光與多色熒光成像能力，綜合表現(xiàn)優(yōu)于同類設(shè)備，可無縫搭配 Stain-Free 免染流程，在電泳、轉(zhuǎn)印全環(huán)節(jié)完成質(zhì)控，完美適配總蛋白歸一化分析需求。

儀器搭載簡易易上手的 Image Lab Touch 軟件，上手門檻低，幾分鐘即可完成圖像采集。它支持單膜同步檢測三種蛋白，可精準(zhǔn)區(qū)分并定量磷酸化等微小翻譯后修飾，化學(xué)發(fā)光靈敏度更是媲美甚至超越傳統(tǒng)壓片法。

圖 5 ChemiDoc MP 成像系統(tǒng)在 WB 實(shí)驗(yàn)中的作用

更可靠的是，設(shè)備采用專屬 .scn 不可篡改原始數(shù)據(jù)格式，搭配賬號(hào)權(quán)限分級、禁止數(shù)據(jù)刪除與拷貝等多重安全管控，完整留存成像參數(shù)、時(shí)間戳等元數(shù)據(jù)，從硬件與軟件雙重維度筑牢原始數(shù)據(jù)防線，滿足頂刊對 WB 圖像溯源、數(shù)據(jù)完整性的要求。

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結(jié)論

圖像合規(guī)、完整溯源、科學(xué)定量，是當(dāng)下 WB 實(shí)驗(yàn)順利發(fā)表的三大核心要點(diǎn)。

熟悉修圖邊界、做好文件存檔，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)體系選擇穩(wěn)定性更佳的 Stain-Free 總蛋白歸一化方法，可以讓實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更扎實(shí)、審稿更順暢。

而專業(yè)設(shè)備是落實(shí)各項(xiàng)規(guī)范的重要支撐，ChemiDoc MP 成像系統(tǒng)不僅擁有高靈敏度成像、多色熒光同步檢測等性能優(yōu)勢，還憑借專屬數(shù)據(jù)格式、權(quán)限管控等功能杜絕原始數(shù)據(jù)篡改問題，全程匹配頂刊溯源要求，結(jié)合 Stain-Free 流程實(shí)現(xiàn)全環(huán)節(jié)質(zhì)控，全方位為 WB 實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)合規(guī)與科研誠信保駕護(hù)航。

注：

1. 相關(guān)產(chǎn)品僅限科研使用，不作為臨床診斷。

2. Bio-Rad 為 Bio-Rad Laboratories, Inc. 在特定區(qū)域的商標(biāo)。本文所使用的所有商標(biāo)均歸其各自所有者所有。? 2026 Bio-Rad Laboratories, Inc.

3. 本活動(dòng)的最終解釋權(quán)歸伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。

內(nèi)容策劃：沈佳鈺

內(nèi)容審核：周育紅

題圖來源：圖蟲創(chuàng)意

參考文獻(xiàn)：

[1] Maloy A et al. (2023). Stain-Free total-protein normalization enhances the reproducibility of Western blot data. Anal Biochem 654, 114840.