Adv Sci?| 李建/錢衛(wèi)平/李長忠/孫青原合作揭示MIS12直接結(jié)合微管調(diào)控卵母細(xì)胞染色體分離的新機(jī)制

卵母細(xì)胞非整倍性（Aneuploidy）的高發(fā)是導(dǎo)致高齡女性不孕、習(xí)慣性流產(chǎn)及出生缺陷（如唐氏綜合征）的核心原因。卵母細(xì)胞減數(shù)分染色體精確分離高度依賴于動粒-微管（K-MT）的正確穩(wěn)定連接。由KNL1、MIS12和NDC80復(fù)合體組成的KMN網(wǎng)絡(luò)被認(rèn)為是介導(dǎo)動粒捕捉微管的保守“錨點(diǎn)”，但在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂這一特殊生理過程中，MIS12蛋白的確切定位與功能尚存在爭議。

此前有研究認(rèn)為，MIS12在小鼠卵母細(xì)胞中定位于紡錘體兩極而非染色體的動粒，且對K-MT連接并非必需。這一觀點(diǎn)挑戰(zhàn)了KMN網(wǎng)絡(luò)的經(jīng)典模型。

近日，北京大學(xué)深圳醫(yī)院李建、錢衛(wèi)平、李長忠與廣東省第二人民醫(yī)院孫青原合作在Advanced Science期刊在線發(fā)表了題為MIS12 Is Required for Kinetochore-Microtubule Attachment in Oocyte Meiosis的研究論文。該研究通過構(gòu)建卵母細(xì)胞特異性敲除小鼠模型，結(jié)合染色體鋪片技術(shù)，糾正了此前關(guān)于MIS12定位的認(rèn)知，并首次發(fā)現(xiàn)MIS12可通過直接結(jié)合beta-tubulin（TUBB3/5）介導(dǎo)動粒-微管連接的新機(jī)制，為理解女性卵母細(xì)胞減數(shù)分裂缺陷提供了全新視角。

MIS12缺失導(dǎo)致卵母細(xì)胞嚴(yán)重發(fā)育障礙及不孕

研究人員利用Zp3-Cre系統(tǒng)構(gòu)建了卵母細(xì)胞特異性敲除Mis12的條件型敲除（cKO）小鼠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Mis12-cKO雌鼠表現(xiàn)為完全不孕。盡管缺失MIS12的卵母細(xì)胞能排出第一極體，但受精后胚胎發(fā)育到2-細(xì)胞階段即停止并發(fā)生退化。免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)，缺失MIS12的MII期卵母細(xì)胞染色體分布嚴(yán)重散亂，無法排列在赤道板，紡錘體形態(tài)結(jié)構(gòu)亦存在異常。

澄清爭議：MIS12精準(zhǔn)定位于動粒

針對此前MIS12定位的爭議，研究團(tuán)隊利用高分辨率的染色體鋪片技術(shù)（Chromosome Spreading），在小鼠和人類卵母細(xì)胞中均觀察到內(nèi)源性MIS12精準(zhǔn)定位于動粒位置。這一發(fā)現(xiàn)確立了MIS12在哺乳動物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中發(fā)揮功能的核心空間基礎(chǔ)。

MIS12介導(dǎo)K-MT連接不依賴于NDC80的定位

在經(jīng)典模型中，NDC80復(fù)合體被視為動粒和微管互作的直接界面，MIS12則被視為連接內(nèi)層動粒與外層NDC80復(fù)合物的支架蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，在缺失MIS12的卵母細(xì)胞中，NDC80蛋白水平雖然略有下降，但依然能夠清晰定位于動粒。重要的是，單純補(bǔ)充NDC80并不能挽救MIS12缺失導(dǎo)致的染色體排列缺陷。

研究人員通過酵母雙雜交（Y2H）篩選發(fā)現(xiàn)，MIS12能直接與beta-tubulin（TUBB3）相互作用。進(jìn)一步通過免疫共沉淀（Co-IP）和鄰位連接實(shí)驗(yàn)（PLA）證實(shí)，MIS12與微管蛋白（TUBB3和TUBB5）之間存在直接結(jié)合。有意思的是，當(dāng)研究人員通過人工手段將MIS12拴系在NDC80（NDC80-MIS12）或染色體（H2B-MIS12）上時，均能有效修復(fù)Mis12-cKO卵母細(xì)胞的染色體排列和K-MT連接缺陷（圖1）。這表明，在卵母細(xì)胞中MIS12不僅是一個支架蛋白，更是一個能直接結(jié)合微管的功能蛋白，這一發(fā)現(xiàn)刷新了我們對KMN網(wǎng)絡(luò)工作模式的認(rèn)知。

圖1. MIS12拴系在NDC80（NDC80-MIS12）或染色體（H2B-MIS12）上均可有效修復(fù)Mis12-cKO卵母細(xì)胞的染色體排列和K-MT連接缺陷。

MIS12是維持SAC信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)（SAC）是監(jiān)控染色體分離的關(guān)鍵感應(yīng)器。研究顯示，缺失MIS12會導(dǎo)致KNL1無法組裝到動粒上，進(jìn)而導(dǎo)致下游SAC成員蛋白（如MAD2、BubR1、BUB3）的募集失敗，從而致使卵母細(xì)胞在染色體未正確連接和排列的情況下過早排放第一極體，最終引發(fā)嚴(yán)重的非整倍性。

本研究不僅確立了MIS12在卵母細(xì)胞動粒上的經(jīng)典定位，更提出了一個新的卵母細(xì)胞調(diào)控染色體分離的潛在分子機(jī)制：MIS12通過直接結(jié)合beta-tubulin介導(dǎo)動粒與微管的相互作用，且這一功能在維持卵母細(xì)胞SAC活性及染色體整倍性中至關(guān)重要。

圖2. MIS12對卵母細(xì)胞減數(shù)分裂染色體動粒的連接和KNL1組裝至關(guān)重要。

值得注意的是，該團(tuán)隊目前在臨床65例不孕癥樣本中發(fā)現(xiàn)，超過60%的患者攜帶MIS12基因突變。這一發(fā)現(xiàn)提示MIS12可能是研究導(dǎo)致人類臨床卵子質(zhì)量低下的重要候選靶點(diǎn)，為未來生殖障礙的基因篩查診斷提供了理論參考。

北京大學(xué)深圳醫(yī)院李建、錢衛(wèi)平、李長忠以及廣東省第二人民醫(yī)院孫青原為本文的通訊作者。李建同時為本文的第一作者。

原文鏈接：https://doi.org/10.1002/advs.76171

制版人：十一

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