浙江大學李承喜&張治國JACS：PMDA四功能連接子實現賴氨酸選擇性環化與自動化大環組裝

導讀

環肽因兼具較高構象穩定性、良好靶標識別能力和可調控的功能展示方式，已成為化學生物學和藥物發現中的重要分子骨架。肽鏈“釘合”（peptide stapling）能夠通過共價連接兩個特定位點來限制肽鏈構象，從而提高抗蛋白酶降解能力和生物功能。然而，現有釘合策略往往依賴非天然氨基酸或半胱氨酸等特定反應位點，在底物適用性、化學選擇性、后期功能化能力和自動化兼容性之間仍難以兼顧。

PMDA連接子驅動賴氨酸選擇性環化、后期功能化與自動化大環組裝

針對這一瓶頸，浙江大學李承喜教授和張治國教授報道了一種基于商業化小分子焦均苯四甲酸二酐（pyromellitic dianhydride, PMDA）的賴氨酸–賴氨酸選擇性環化新策略。該方法利用PMDA的四功能反應特征，在溫和條件下實現未保護肽中賴氨酸ε-氨基的高選擇性分子內雙酰胺化，同時保留兩個羧酸手柄用于后續功能化。相關成果以“A Modular PMDA Linker Enables Lysine-Selective Cyclization of Unprotected Peptides and Automated Macrocycle Assembly”為題發表于Journal of the American Chemical Society。

PMDA連接子：一次反應，同時完成環化與功能手柄安裝

PMDA通常用于聚酰亞胺等材料化學中，其酸酐結構可被胺類親核試劑開環。作者注意到，含有兩個賴氨酸的肽序列具有柔性ε-氨基和一定的分子內預組織效應，可能誘導PMDA優先發生分子內雙酰胺化，而不是無序的分子間聚合或多位點修飾。基于這一設想，團隊將PMDA重新定義為一種面向肽大環構建的四功能連接子：其中兩個酸酐羰基與兩個賴氨酸ε-氨基形成酰胺鍵，實現Lys–Lys stapling；另外兩個開環后形成的羧酸則作為后續偶聯和結構拓展的功能手柄。

因此，PMDA并不是一個簡單的交聯試劑，而是在一次反應中同時完成“環化”和“功能手柄安裝”，從而為單環肽、雙環肽以及多功能偶聯物的構建提供了統一平臺。

圖1｜研究策略示意圖。與已有Lys–Lys stapling策略相比，本工作使用PMDA作為四功能連接子，既實現賴氨酸選擇性環化，又保留兩個羧酸手柄用于后續功能化，并與固相/自動化合成兼容

溫和而高選擇性的非保護肽賴氨酸環化

作者首先以Ac-KFPFK-NH2作為模型底物，對堿、溶劑、溫度和當量進行系統篩選。結果顯示，在HFIP/MeCN體系中，以TMG為堿可以顯著促進分子內雙酰胺化，并抑制單修飾和二聚副產物的生成。優化后，模型肽環化可獲得很高的LC估算收率。更重要的是，該反應表現出優異的氨基酸兼容性。

作者設計了覆蓋Asp、Glu、Ser、Thr、Tyr、His、Trp、Met、Arg、Cys等多種潛在反應性側鏈的未保護肽，LC-MS結果表明這些非賴氨酸殘基均未發生可檢測的PMDA衍生修飾，說明該體系對賴氨酸ε-氨基具有高度選擇性。

圖2｜PMDA介導Lys–Lys stapling的條件優化與化學選擇性驗證。TMG/HFIP–MeCN體系可高效促進模型肽分子內環化，并在多種活潑側鏈存在時仍保持對賴氨酸ε-氨基的優異選擇性

從底物拓展到雙環化與后期偶聯

在底物范圍方面，作者系統考察了i+0到i+7不同間隔的賴氨酸位點，均可順利發生分子內環化，說明該策略對環尺寸和間隔長度具有較強適應性。進一步地，在多種具有潛在抗菌活性的肽序列中，該反應同樣能夠穩定運行，表現出良好的序列適應性和官能團耐受性。

圖3｜底物范圍研究。無論是不同Lys間隔的底物，還是包含復雜側鏈的肽序列，均可高效發生PMDA介導的大環化

PMDA環化產物中保留的兩個羧酸手柄進一步打開了高階結構構建空間。團隊通過羧酸活化與第二段肽鏈接入，構建了一系列雙環肽；同時還實現了與PNA、小分子藥物氨氯地平以及生物素標簽的雙位點偶聯，甚至獲得同時含有氨氯地平和生物素的異雙功能化產物。

圖4｜PMDA環化產物的應用拓展。保留的雙羧酸手柄可用于模塊化構建雙環肽，并可進一步實現PNA偶聯、藥物偶聯和生物素標記等后期功能化

提升功能肽穩定性，并無縫接入自動化平臺

為驗證該策略在功能肽中的應用潛力，作者選擇黃蜂毒素來源的抗菌肽anoplin作為模型。PMDA單環化和雙環化顯著提高了肽的蛋白酶穩定性；CD光譜顯示，PMDA環化能夠增強肽鏈構象約束；抗菌測試也表明，PMDA釘合后的肽對MRSA的活性優于相應線性肽。

圖5｜PMDA釘合對功能肽性質的影響。以anoplin為模型，單環/雙環化顯著提升蛋白酶穩定性，并在MRSA測試中保持甚至改善抗菌活性

該化學策略還被成功移植到固相合成和自動化合成平臺中。通過Alloc選擇性脫保護后，PMDA可在樹脂上實現賴氨酸側鏈間環化。進一步地，團隊將氨基酸組裝、保護基操作和PMDA環化整合到CycloBot自動化平臺中，在無需硬件改造的情況下實現端到端自動化大環組裝。與手動固相流程相比，自動化流程顯著縮短操作時間，并提高了目標環肽的合成效率。

圖6｜PMDA介導環化與自動化合成兼容。作者在CycloBot平臺上實現了從肽鏈組裝、脫保護到PMDA環化的一體化自動流程，顯著提升了宏環組裝效率

總結與展望

這項工作將一個商業化、廉價易得的材料化學單體PMDA轉化為面向環肽藥物發現的四功能連接子，實現了未保護肽中賴氨酸選擇性環化、雙羧酸手柄安裝、雙環肽構建、多功能偶聯以及自動化合成的集成。該策略為環肽分子的快速制備、后期修飾和自動化篩選提供了新的通用工具，也進一步拓展了可編程肽合成平臺的化學能力。

論文第一作者為浙江大學吳嘉樹、詹汪琳和楊星星，通訊作者為浙江大學李承喜教授和張治國教授。研究得到國家重點研發計劃、國家自然科學基金創新研究群體、國家自然科學基金、博士后創新人才支持計劃和中國博士后科學基金等項目支持。

論文信息

論文標題：A Modular PMDA Linker Enables Lysine-Selective Cyclization of Unprotected Peptides and Automated Macrocycle Assembly

論文作者：Jiashu Wu?, Wanglin Zhan?, Xingxing Yang?, Chengxi Li*, Qiwei Yang, Zongbi Bao, Qilong Ren, Zhiguo Zhang*

原文鏈接：https://doi.org/10.1021/jacs.6c09909