Immunity?| CRISPR介導的大片段精準插入技術加速人源化小鼠模型構建

撰文 | 格格

目前，將大于10 kb的DNA片段精準插入特定基因組位點仍面臨重大技術瓶頸。傳統的CRISPR-Cas9方法依賴同源定向修復（HDR）修復雙鏈斷裂，但其效率隨插入片段增大而顯著下降【1】，且在異染色質豐富區域、原代細胞及非分裂細胞中挑戰更為突出【2】。現有遞送載體（如質粒或單鏈DNA）存在尺寸限制，大質粒結合電穿孔還會引發細胞毒性，干擾DNA修復機制【3】；同時，Cas9的錯配耐受性也增加了脫靶風險【4】。盡管近年涌現出TwinPE、PASTE和eePASSIGE等新技術，可將哺乳動物細胞系的插入能力提升至10.5–36 kb，但仍無法實現數量級上的突破，且其在直接生成攜帶大片段基因敲入小鼠中的應用尚未得到驗證。基于胚胎干細胞（ES細胞）的非CRISPR方法（如RMCE和RMGR）雖能實現超過100 kb的整合，但需經歷嵌合體篩選和多代繁殖以獲得種系傳遞，耗時費力。

近日 ， 來自美國哈佛大學的Facundo D. Batista和Usha Nair研究團隊合作在Immunity雜志發表題為CRISPR-mediated precise large fragment insertionin zygotes enables rapid generation of humanizedimmunoglobulin heavy-chain mice的研究論文， 該研究旨在建立一種基于CRISPR-Cas9的高效大片段基因敲入技術，以突破合子階段插入大于150 kb DNA片段的難題，并快速生成功能完整的人源化抗體小鼠模型。

首先，研究人員為了建立人源化免疫球蛋白重鏈（IgH）小鼠模型，先利用CRISPR-Cas9介導的NHEJ修復途徑，通過四組sgRNA靶向切割小鼠VH位點的兩端，成功實現了約2.4 Mb小鼠VH基因座的大片段刪除。在獲得的21只F0代小鼠中，有4只（約19%）攜帶完整的VH敲除，且該等位基因能以孟德爾比例穩定種系傳遞。流式細胞術證實，純合VH敲除小鼠外周血中完全缺失B220 + B細胞，表明小鼠VH位點被徹底刪除。同時，研究人員采用相同策略，也成功實現了約3.1 Mb小鼠Vκ位點的刪除，證實該多sgRNA策略可在不同基因組位點高效介導大片段缺失。

接著，研究人員在VH敲除小鼠基礎上，通過顯微注射含有人源VH3-33基因、小鼠啟動子及同源臂的單鏈DNA模板，結合CRISPR-Cas9介導的HDR修復，將單個0.294 kb的人VH3-33片段精準插入小鼠基因組。在17只F0代小鼠中，11只（69%）成功整合，其中7只恢復了B220 + B細胞表達。單細胞測序顯示，人VH3-33能夠與小鼠D/J段進行重組，并配對小鼠輕鏈，HCDR3長度分布與野生型相似。更重要的是，該人源化B細胞能夠結合惡性瘧原蟲環子孢子蛋白（PfCSP）四聚體，并在過繼轉移后參與體內生發中心反應，證實單個人VH片段具備功能活性。

進一步，研究人員探索了更大片段和多基因整合的可行性。他們先設計了一個包含5個人VH基因的24-kb合成微型基因構建體，兩側為5-kb同源臂，注射入VH敲除合子后成功獲得兩株正確整合的F0小鼠，并穩定種系傳遞。隨后，他們進一步挑戰了155 kb的大片段插入，使用攜帶18個人VH基因（含8個功能性片段）的BAC載體，兩側為20-kb同源臂，注射668枚合子后獲得51只活鼠，其中7只（約14%）攜帶BAC插入。全基因組測序確認F0-16小鼠實現了完整單拷貝、無脫靶的精準整合，而F0-29則存在部分缺失。該大片段插入支持B細胞發育，且整合的人VH片段能與小鼠J段重組并保持輕鏈多樣性，sgRNA脫靶分析僅在F0-29中檢測到3個真實脫靶位點。

最后，研究人員驗證了該人源化小鼠模型的免疫應答功能。他們將F1代VH BAC人源化小鼠免疫接種流感HA莖部免疫原（H1ssF-np），結果發現免疫組小鼠產生了明顯的生發中心反應和IgG類別轉換，HA莖部特異性B細胞顯著擴增（約占GC B細胞的9%），而對照組幾乎沒有響應。單細胞測序顯示，免疫后VH1-69和VH1-69D克隆發生擴增，并累積了體細胞高頻突變，其中部分突變（如T28P、Y98-100等）是已知與廣譜中和抗體相關的關鍵突變。此外，研究人員進一步將人源化范圍擴展至D/J段，通過CRISPR介導將內源小鼠DH-JH區域替換為含9個人DH和6個人JH的合成構建體，成功獲得了10只（55.6%）攜帶完全人源化V(D)J重組能力的F0小鼠，其HCDR3長度分布和輕鏈配對多樣性均與野生型相近。這一兩步式連續人源化策略最終實現了功能性完全人源化重鏈小鼠的快速構建。

圖一 CRISPR介導的大片段精準插入技術加速人源化小鼠模型構建

總之，該研究開發了一種能夠在合子中直接精準插入超過150 kb大片段DNA的CRISPR-Cas9方法，可在8周內快速生成功能完整的人源化免疫球蛋白重鏈小鼠，為無需胚胎干細胞操作和多代繁育的大片段基因敲入模型構建提供了通用平臺。

https://www.cell.com/immunity/fulltext/S1074-7613(26)00259-1

制版人： 十一

參考文獻

1. Liao, H., Wu, J., VanDusen, N.J., Li, Y., and Zheng, Y. (2024). CRISPRCas9-mediated homology-directed repair for precise gene editing.Mol. Ther., Nucleic Acids35, 102344.

2. Yang, H., Wang, H., Shivalila, C.S., Cheng, A.W., Shi, L., and Jaenisch, R. (2013). One-Step Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering.Cell154, 1370–1379.

3. Yang, H., Wang, H., Shivalila, C.S., Cheng, A.W., Shi, L., and Jaenisch, R. (2013). One-Step Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering.Cell154, 1370–1379.

4. Lin, Y., Cradick, T.J., Brown, M.T., Deshmukh, H., Ranjan, P., Sarode, N., Wile, B.M., Vertino, P.M., Stewart, F.J., and Bao, G. (2014). CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences.Nucleic Acids Res. 42, 7473–7485.

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