Adv Funct Mater (IF=19.9)｜抗體治療邁向?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)：CP1.1雙傳感平臺(tái)同步檢測(cè)阿達(dá)木單抗與抗藥抗體！(陳嘯飛/樊芳/張鳳/劉耀陽(yáng)/李全團(tuán)隊(duì))

2026年7月6日，海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系陳嘯飛/樊芳教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合第二附屬醫(yī)院張鳳教授、第三附屬醫(yī)院劉耀陽(yáng)教授團(tuán)隊(duì)，在Advanced Functional Materials (中科院1區(qū)，TOP期刊，IF=19.9）發(fā)表題為“Paratope-Specific Recognition Biosensing Materials for Real-Time Monoclonal Antibody Detection and Personalized Therapy”的研究論文。該文于2025年11月30日投稿，2026年5月30日修回，2026年6月22日接收。

海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系陳嘯飛、樊芳，第二附屬醫(yī)院張鳳，第三附屬醫(yī)院劉耀陽(yáng)為論文的共同通訊作者；研究生陳雨、張雨欣，第二附屬醫(yī)院/同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬淞南鎮(zhèn)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心龐濤為論文的共同第一作者。該研究開展過(guò)程中得到大學(xué)“深藍(lán)人才工程”特聘導(dǎo)師東南大學(xué)李全教授，藥學(xué)系柴逸峰教授，第二附屬醫(yī)院陳萬(wàn)生教授的關(guān)鍵指導(dǎo)。

單克隆抗體藥物已廣泛用于腫瘤、自身免疫病和感染性疾病治療，但臨床療效常受到抗藥抗體（anti-drug antibody，ADA）產(chǎn)生的影響。如何快速、準(zhǔn)確、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)單抗藥物濃度和ADA水平，是實(shí)現(xiàn)個(gè)體化給藥和精準(zhǔn)治療的重要前提。

該研究以阿達(dá)木單抗（adalimumab，ADL）為模型藥物，提出一種雙重生物傳感策略：一方面，研究建立基于F(ab′)2片段的雙向正/負(fù)噬菌體展示篩選方法，成功篩選出可識(shí)別ADL抗原結(jié)合位點(diǎn)的環(huán)肽CP1；另一方面，研究利用ADL來(lái)源單鏈可變片段（single-chain variable fragment，scFv）作為ADA識(shí)別單元。隨后，團(tuán)隊(duì)將優(yōu)化后的CP1.1和c-scFv分別修飾到金納米顆粒（AuNPs）表面，構(gòu)建CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs傳感材料，實(shí)現(xiàn)ADL和ADA的快速定量檢測(cè)。

結(jié)果顯示，該體系可在約2分鐘內(nèi)完成檢測(cè)，與傳統(tǒng)ELISA結(jié)果高度一致，并已應(yīng)用于33例強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）患者的ADL和ADA動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。研究提示，該類“抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性識(shí)別”生物傳感材料有望為單抗藥物治療中的治療藥物監(jiān)測(cè)（therapeutic drug monitoring，TDM）、免疫原性評(píng)估和個(gè)體化用藥調(diào)整提供新工具。

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【摘 要】

單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）治療藥物已成為腫瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病的重要治療手段。然而，抗藥抗體（anti-drug antibody，ADA）的形成常會(huì)削弱其療效。準(zhǔn)確、動(dòng)態(tài)檢測(cè)mAb藥物和ADA，對(duì)于早期免疫原性評(píng)估和個(gè)體化給藥具有重要意義。

本研究以阿達(dá)木單抗（adalimumab，ADL）為模型，開發(fā)了一種雙重生物傳感策略，可同時(shí)定量檢測(cè)mAb藥物和ADA。為解決mAb檢測(cè)中缺乏抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性識(shí)別元件的問(wèn)題，研究建立了基于F(ab′)2片段的雙向正/負(fù)噬菌體展示篩選方法，用于去除同源IgG干擾。通過(guò)該方法，研究成功鑒定出一種ADL抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性識(shí)別肽CP1，其與ADL具有較高親和力，解離常數(shù)KD為7.84 μM。

對(duì)于ADA識(shí)別，研究采用ADL來(lái)源的單鏈可變片段（single-chain variable fragment，c-scFv）作為靶向ADA抗原結(jié)合位點(diǎn)的識(shí)別單元。隨后，研究將CP1和c-scFv分別偶聯(lián)至金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs），構(gòu)建用于ADL和ADA檢測(cè)的生物傳感材料CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs。該體系可在2分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速定量，其檢測(cè)結(jié)果與ELISA結(jié)果高度相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R2=0.99。

這些經(jīng)抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性識(shí)別元件功能化的生物傳感器，已成功用于33例強(qiáng)直性脊柱炎患者體內(nèi)ADL和ADA的實(shí)時(shí)檢測(cè)。該策略可支持個(gè)體化治療方案優(yōu)化，并為mAb治療的精準(zhǔn)管理提供一種實(shí)用方法。

01

研究背景及科學(xué)問(wèn)題

單克隆抗體（mAb）治療藥物因具有高度特異性和良好臨床療效，已被廣泛用于腫瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病的靶向治療。2024年，全球銷量排名前十的藥物中，mAb藥物占據(jù)半數(shù)，遠(yuǎn)超小分子藥物，其臨床應(yīng)用仍在逐年增長(zhǎng)。然而，隨著mAb藥物臨床應(yīng)用不斷增加，一些關(guān)鍵問(wèn)題逐漸顯現(xiàn)，包括治療過(guò)程中難以快速、準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)藥物暴露水平，以及抗藥抗體（ADA）產(chǎn)生等。

當(dāng)外源性mAb被機(jī)體識(shí)別為外來(lái)抗原時(shí)，免疫系統(tǒng)會(huì)啟動(dòng)反應(yīng)并產(chǎn)生ADA。中和性ADA可直接結(jié)合治療性抗體，阻斷其與靶點(diǎn)相互作用，從而消除藥物活性。非中和性ADA雖然不直接干擾藥物功能，但可與藥物形成免疫復(fù)合物并加速清除，導(dǎo)致血清藥物濃度持續(xù)偏低，無(wú)法維持治療水平。因此，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)mAb濃度和ADA水平具有重要臨床價(jià)值，可用于早期預(yù)警、準(zhǔn)確診斷和及時(shí)干預(yù)。

然而，mAb、ADA與內(nèi)源性IgG在結(jié)構(gòu)上高度相似，僅在抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域中存在少數(shù)氨基酸差異，因此同時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)mAb和ADA非常困難。造成這一困境的主要原因在于：絕大多數(shù)mAb藥物缺乏特異性識(shí)別元件，同時(shí)也缺少實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)方法。

肽類分子因分子量低、穩(wěn)定性好、結(jié)構(gòu)可調(diào)，被認(rèn)為是mAb理想識(shí)別元件。與抗體或適配體相比，肽探針在傳感界面上可實(shí)現(xiàn)更高表面密度和更均一固定，從而獲得穩(wěn)定一致的識(shí)別性能。目前，開發(fā)mAb靶向肽的策略主要包括計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和噬菌體展示篩選。前者依賴已知抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證之間往往一致性有限；后者在篩選過(guò)程中常受到非特異性IgG結(jié)合干擾。由于抗體Fc區(qū)域高度同源，如何消除IgG干擾并篩選出真正抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性肽，仍是重要挑戰(zhàn)。

為解決這一問(wèn)題，本研究開發(fā)了基于F(ab′)2片段的雙向正/負(fù)噬菌體展示篩選策略。該方法使用酶切獲得的F(ab′)2片段作為靶分子，從而使噬菌體優(yōu)先結(jié)合抗體可變區(qū)。同時(shí)，該策略在三輪篩選中結(jié)合針對(duì)IgG的負(fù)篩選和針對(duì)F(ab′)2片段的正向富集，可有效去除IgG交叉反應(yīng)肽，并保留高抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合序列。由于不同患者產(chǎn)生的ADA具有差異，通用肽探針并不適用于ADA檢測(cè)，因此研究采用單鏈可變片段（scFv）作為識(shí)別單元。該片段可保留抗體特異性和結(jié)合能力，同時(shí)在不同pH和溫度條件下具有更好的穩(wěn)定性。

阿達(dá)木單抗（ADL）是臨床最常用的mAb藥物之一，因此本研究選擇其作為模型，用于開發(fā)藥物和ADA水平動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)策略。目前，臨床上ADL和ADA檢測(cè)方法尚未標(biāo)準(zhǔn)化。雖然已有多種基于ELISA的方法，但其依賴TNF-α蛋白和ADL作為識(shí)別元件，存在成本高、穩(wěn)定性差、制備復(fù)雜等限制。

本研究將篩選獲得的ADL靶向環(huán)肽CP1（ACNPAHNNYCGGGS）和ADL來(lái)源單鏈可變片段c-scFv偶聯(lián)至AuNPs，分別形成用于ADL檢測(cè)的CP1.1@AuNPs和用于ADA檢測(cè)的c-scFv@AuNPs。該系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果與ELISA結(jié)果的一致性達(dá)到0.99，并可用于強(qiáng)直性脊柱炎患者ADL和ADA水平的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，為抗體藥物精準(zhǔn)給藥提供了新的方法。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點(diǎn)

建立基于F(ab′)2片段的雙向正/負(fù)噬菌體展示篩選策略

噬菌體展示技術(shù)可通過(guò)反復(fù)篩選富集高親和力肽結(jié)合物，但在識(shí)別mAb特異性肽時(shí)，會(huì)受到大量?jī)?nèi)源性IgG的強(qiáng)烈干擾。mAb保守結(jié)構(gòu)，尤其是Fc區(qū)域，會(huì)限制其抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性；同時(shí)，生物樣本中IgG水平遠(yuǎn)高于藥物抗體，因此所需肽探針必須具備極高特異性和親和力。

為克服這些限制，研究設(shè)計(jì)了基于F(ab′)2片段的正/負(fù)篩選策略。該方法去除Fc區(qū)域，以減少非特異性IgG結(jié)合，同時(shí)富集識(shí)別ADL特異性互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity-determining regions，CDRs）的克隆。通過(guò)先去除IgG結(jié)合噬菌體，再篩選固定化ADL-F(ab′)2，該連續(xù)篩選流程可有效排除交叉反應(yīng)克隆，并富集對(duì)ADL具有高特異性的肽序列。

圖1：ADL抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性識(shí)別肽篩選流程，以及將其功能化至AuNPs用于ADL和ADA精準(zhǔn)檢測(cè)的總體示意圖。（a）采用基于F(ab′)2的正/負(fù)噬菌體展示篩選策略，篩選ADL特異性環(huán)肽。（b）利用功能化AuNPs建立ADL和ADA定量分析方法；功能化元件包括環(huán)肽以及ADL的scFv片段，圖由BioRender繪制。（c）所開發(fā)的ADL和ADA同步檢測(cè)方法可用于AS患者實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，圖由BioRender繪制。通過(guò)整合參數(shù)分析和強(qiáng)直性脊柱炎疾病活動(dòng)評(píng)分（Ankylosing Spondylitis Disease Activity Score，ASDAS）評(píng)估，該方法為臨床精準(zhǔn)用藥提供了一條新路徑。

篩選獲得ADL抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性識(shí)別肽CP1

研究采用IgG正/負(fù)雙相噬菌體展示策略，以ADL-F(ab′)2片段為靶標(biāo)，對(duì)環(huán)狀七肽噬菌體文庫(kù)進(jìn)行篩選。在三輪篩選中，每輪均預(yù)先去除對(duì)IgG具有親和力的噬菌體，以提高靶向特異性。

結(jié)果顯示，在各輪輸入噬菌體滴度基本一致的情況下，回收率逐步升高：第一輪為1.13×10?6，第三輪升至1.61×10?4。回收率持續(xù)升高說(shuō)明具有目標(biāo)特異性親和力的噬菌體被成功擴(kuò)增和富集，也證明洗脫和篩選步驟有效。

在第三輪篩選后，研究進(jìn)一步采用包被ADL-F(ab′)2或IgG的微孔板進(jìn)行噬菌體滴定實(shí)驗(yàn)。ADL-F(ab′)2包被板中，即使稀釋至104倍，噬菌斑仍多到難以計(jì)數(shù)，直到106倍稀釋才出現(xiàn)可見藍(lán)色噬菌斑；相反，IgG結(jié)合噬菌體在102倍稀釋后僅有43個(gè)噬菌斑，103倍稀釋后僅有4個(gè)噬菌斑。該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明富集噬菌體對(duì)ADL-F(ab′)2具有特異性，而與IgG交叉反應(yīng)較弱。

隨后，研究從第三輪滴定板中隨機(jī)挑選30個(gè)陽(yáng)性單克隆噬菌體進(jìn)行Sanger測(cè)序。共鑒定出6種不同肽序列，并按出現(xiàn)頻率命名為CP1至CP6。其中CP1出現(xiàn)15次，占所有序列的50.00%，為最富集序列；CP2和CP3各出現(xiàn)4次，占13.33%；CP4出現(xiàn)3次，占10.00%；CP5和CP6各出現(xiàn)2次，占6.67%。

圖2：F(ab′)2片段雙向正/負(fù)噬菌體展示篩選結(jié)果。（a）各輪篩選中噬菌體輸入量和回收率比較。（b）洗脫噬菌體克隆得到的肽序列。（c）第三輪洗脫液與陽(yáng)性抗體ADL-F(ab′)2及陰性抗體IgG之間的藍(lán)色噬菌斑計(jì)數(shù)比較。（d）最終一輪篩選所得噬菌體的測(cè)序結(jié)果。

CP1表現(xiàn)出對(duì)ADL的較高親和力和特異性

獲得陽(yáng)性克隆序列后，研究首先采用噬菌體ELISA初步評(píng)估CP1—CP6的特異性。結(jié)果顯示，展示CP1、CP2、CP4、CP5和CP6的噬菌體與ADL-F(ab′)2結(jié)合時(shí)的響應(yīng)值顯著高于IgG對(duì)照，而CP3的差異不明顯。這提示CP1、CP2、CP4、CP5和CP6對(duì)ADL-F(ab′)2具有一定特異性，但仍需進(jìn)一步驗(yàn)證親和力。

隨后，研究采用表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)評(píng)價(jià)合成肽的特異性和親和力。所有6種環(huán)肽均通過(guò)固相合成制備，純度均超過(guò)95%，并經(jīng)高效液相色譜（HPLC）和液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）確認(rèn)。研究分別將ADL和IgG固定于CM5傳感芯片，再注入不同濃度肽以檢測(cè)結(jié)合相互作用。

SPR結(jié)果顯示，CP1與ADL具有較高親和力和顯著特異性，解離常數(shù)KD為7.84 μM，并且與IgG無(wú)可檢測(cè)結(jié)合。相比之下，CP2、CP3和CP4不同程度地同時(shí)結(jié)合ADL和IgG，說(shuō)明特異性有限；CP5和CP6對(duì)ADL或IgG均未顯示可測(cè)量結(jié)合。綜合噬菌體ELISA和SPR結(jié)果，CP1被確定為最有潛力的候選肽，用于后續(xù)開發(fā)。

研究進(jìn)一步利用分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬解析CP1與ADL-F(ab′)2之間的相互作用。AutoDock Tools 1.5.6對(duì)接結(jié)果顯示，CP1與ADL-F(ab′)2具有較強(qiáng)結(jié)合親和力，結(jié)合能為?7.99 kcal·mol?1。通常結(jié)合能低于?7.00 kcal·mol?1提示相互作用較強(qiáng)，負(fù)值則說(shuō)明結(jié)合可自發(fā)發(fā)生，支持二者形成穩(wěn)定復(fù)合物。結(jié)構(gòu)模型顯示，CP1與ADL-F(ab′)2之間的相互作用主要由氫鍵網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定。

殘基水平結(jié)合能分析表明，ADL-F(ab′)2中的Thr-173、Phe-174和Tyr-95對(duì)結(jié)合貢獻(xiàn)最大，結(jié)合能分別為?1.90、?1.80和?1.40 kcal·mol?1，提示這些殘基在維持復(fù)合物穩(wěn)定性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，Glu-156、Val-160和Glu-165等殘基也參與相互作用，但貢獻(xiàn)相對(duì)較小。這些關(guān)鍵殘基位于配體結(jié)合口袋附近，可共同構(gòu)建協(xié)同相互作用網(wǎng)絡(luò)。

分子動(dòng)力學(xué)模擬進(jìn)一步顯示，ADL-F(ab′)2–CP1復(fù)合物的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）在0.2—0.4 nm之間波動(dòng)，相較游離ADL-F(ab′)2僅略有降低，提示整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。均方根波動(dòng)（root mean square fluctuation，RMSF）分析顯示，兩種體系具有相似波動(dòng)模式，整體數(shù)值約為1 nm，在Thr-173附近存在輕微差異，與分子對(duì)接結(jié)果一致。回轉(zhuǎn)半徑（radius of gyration，Rg）在模擬過(guò)程中穩(wěn)定在約2.4 nm，說(shuō)明CP1結(jié)合不會(huì)引起明顯構(gòu)象改變。氫鍵分析顯示，CP1與ADL-F(ab′)2之間可持續(xù)維持4—7個(gè)氫鍵，最多可達(dá)11個(gè)，提示存在穩(wěn)定分子間相互作用。溶劑可及表面積（solvent-accessible surface area，SASA）分析顯示，兩者曲線幾乎重疊，穩(wěn)定波動(dòng)于約200 nm2，進(jìn)一步說(shuō)明CP1結(jié)合未顯著改變ADL-F(ab′)2整體結(jié)構(gòu)。自由能景觀分析顯示，ADL-F(ab′)2以及ADL-F(ab′)2–CP1復(fù)合物均形成明確最低能量簇，復(fù)合物雖能量分布略寬，但仍處于穩(wěn)定低能狀態(tài)。MM/GBSA計(jì)算得到平均結(jié)合自由能為?31.88 kcal·mol?1，進(jìn)一步證明CP1與ADL-F(ab′)2之間存在較強(qiáng)且有利的結(jié)合。

圖3：環(huán)肽與ADL結(jié)合的驗(yàn)證。（a）噬菌體ELISA實(shí)驗(yàn)原理與流程圖，由BioRender繪制。（b）環(huán)肽CP1—CP6對(duì)ADL和IgG對(duì)照的噬菌體ELISA響應(yīng)。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（S.D.）表示（n=3）。（c）SPR分析CP1與ADL及IgG的結(jié)合親和力。（d）ADL-F(ab′)2與CP1相互作用的分子模擬。（e）ADL蛋白中參與CP1結(jié)合的氨基酸殘基能量貢獻(xiàn)。（f–j）分子動(dòng)力學(xué)（molecular dynamics，MD）分析：（f）RMSD，（g）RMSF，（h）Rg，（i）界面氫鍵，以及（j）SASA。（k）ADL-F(ab′)2上方部分和ADL-F(ab′)2–CP1下方部分的自由能分布圖。

構(gòu)建用于ADL和ADA特異性識(shí)別的AuNPs生物傳感平臺(tái)

鑒于CP1具有較高親和力和特異性，研究進(jìn)一步將其修飾到AuNPs表面，用于構(gòu)建ADL檢測(cè)傳感器。首先，為提高CP1水溶性并便于其與AuNPs偶聯(lián)，研究將CP1 C端GGGS序列替換為KKKC，得到水溶性更好的CP1.1（ACNPAHNNYCKKKC）。CP1.1經(jīng)LC-MS和HPLC表征確認(rèn)。SPR結(jié)果顯示，CP1.1與ADL仍具有良好結(jié)合親和力，KD為3.76 μM，低于CP1，且與IgG無(wú)非特異性結(jié)合。這說(shuō)明CP1.1是一種可特異性結(jié)合ADL且水溶性良好的肽探針。

隨后，研究通過(guò)Au–S鍵將CP1.1偶聯(lián)到AuNPs表面，構(gòu)建CP1.1@AuNPs生物傳感器。由于CP1.1分子尺寸較小、表面堆積密度較高，肽功能化僅在相鄰納米顆粒之間產(chǎn)生較小空間位阻。UV–vis光譜顯示，偶聯(lián)后表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）吸收帶無(wú)明顯變化，說(shuō)明單純肽接枝不會(huì)導(dǎo)致顯著等離子體耦合。透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）進(jìn)一步顯示，表面修飾后雖發(fā)生輕微顆粒間關(guān)聯(lián)，但AuNPs仍基本保持球形形貌和較窄粒徑分布。這提示短肽配體主要發(fā)揮表面穩(wěn)定作用，僅引起有限納米顆粒聚集。

與此同時(shí)，研究將c-scFv作為較大的生物識(shí)別元件用于捕獲ADA，并通過(guò)Au–S鍵偶聯(lián)至AuNPs，得到c-scFv@AuNPs生物傳感器。與CP1.1相比，c-scFv分子尺寸更大、表面堆積密度更低，因此在納米顆粒界面引入更明顯空間效應(yīng)。AuNPs的UV–vis光譜顯示，c-scFv偶聯(lián)后SPR峰輕微紅移，提示局部介電環(huán)境發(fā)生一定變化，但此階段尚未出現(xiàn)強(qiáng)等離子體耦合。TEM圖像顯示，其形貌總體與CP1.1@AuNPs相似，表現(xiàn)為輕度聚集，同時(shí)整體粒徑均一性仍得以保留。

為評(píng)價(jià)CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs分別對(duì)ADL和ADA的響應(yīng)能力，研究系統(tǒng)檢測(cè)其光學(xué)性質(zhì)。當(dāng)向56 μg/mL CP1.1@AuNPs中加入200 μg/mL ADL后，526 nm處SPR吸收峰明顯下降，同時(shí)溶液顏色由粉紅色轉(zhuǎn)為淺藍(lán)紫色，說(shuō)明CP1.1@AuNPs可有效識(shí)別ADL。TEM圖像證實(shí)，加入ADL后CP1.1@AuNPs出現(xiàn)靶標(biāo)誘導(dǎo)聚集。動(dòng)態(tài)光散射（dynamic light scattering，DLS）進(jìn)一步顯示，水合粒徑由約32.70 nm增加至約50.70 nm，提示發(fā)生由肽介導(dǎo)的顆粒間交聯(lián)引起的中等程度聚集。

類似地，向0.5 ng/mL c-scFv@AuNPs中加入200 μg/mL ADA后，526 nm吸收峰明顯降低，并伴隨顏色變化，證實(shí)c-scFv@AuNPs對(duì)ADA具有特異性響應(yīng)。TEM結(jié)果顯示，加入ADA后形成廣泛互聯(lián)的聚集網(wǎng)絡(luò)。DLS檢測(cè)顯示，粒徑由約58.80 nm急劇增加至約712.00 nm，提示形成大規(guī)模顆粒間組裝，并產(chǎn)生更強(qiáng)等離子體耦合效應(yīng)。

值得注意的是，c-scFv@AuNPs誘導(dǎo)的聚集較CP1.1@AuNPs更明顯。這一差異可能與scFv分子量較大有關(guān)。scFv約25—30 kDa，而CP1.1約1—2 kDa。較大的分子尺寸導(dǎo)致scFv表面接枝密度較低，但提供更長(zhǎng)有效結(jié)合距離和更大構(gòu)象靈活性，從而有利于ADA識(shí)別時(shí)橋接相鄰AuNPs，形成更大聚集體并增強(qiáng)等離子體耦合。相比之下，緊湊肽層雖可實(shí)現(xiàn)高表面覆蓋，但主要通過(guò)短程相互作用介導(dǎo)聚集，因此形成的組裝體相對(duì)較小，光譜位移也較弱。

圖4：用于ADL和ADA檢測(cè)的功能化AuNPs生物傳感器構(gòu)建。（a）CP1.1與ADL之間、CP1.1與IgG之間結(jié)合親和力的SPR分析。（b）通過(guò)CP1.1和c-scFv與AuNPs偶聯(lián)構(gòu)建CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs傳感器的示意圖，由BioRender繪制，并分別用于ADL和ADA檢測(cè)。（c）AuNPs、CP1.1@AuNPs和CP1.1@AuNPs@ADL的TEM圖像。（d）CP1.1@AuNPs@ADL的動(dòng)態(tài)光散射圖譜。（e）AuNPs、c-scFv@AuNPs和c-scFv@AuNPs@ADA的TEM圖像。（f）c-scFv@AuNPs@ADA的動(dòng)態(tài)光散射圖譜。（g）AuNPs、CP1.1@AuNPs以及與200 μg/mL ADL孵育后的CP1.1@AuNPs的UV–vis光譜。（h）AuNPs、c-scFv@AuNPs以及與90 AU/mL ADA孵育后的c-scFv@AuNPs的UV–vis光譜。（i）CP1.1@AuNPs（10 μg/mL）對(duì)多種mAb的UV–vis響應(yīng)。數(shù)據(jù)以均值±S.D.表示（n=3）。（j）c-scFv@AuNPs（0.5 ng/mL）對(duì)多種mAb的UV–vis響應(yīng)。數(shù)據(jù)以均值±S.D.表示（n=3）。（k）CP1.1@AuNPs（56 μg/mL）與不同濃度ADL（0、0.5、1、2、5、10、15、20和30 μg/mL）孵育后的UV–vis光譜。插圖顯示CP1.1@AuNPs（56 μg/mL）對(duì)不同濃度ADL的檢測(cè)溶液顏色變化，以及0.5—30 μg/mL范圍內(nèi)A526 nm與ADL濃度的關(guān)系圖。數(shù)據(jù)以均值±S.D.表示（n=3）。（l）c-scFv@AuNPs（0.5 ng/mL）與不同濃度ADA（1、10、25、50、70和90 AU/mL）孵育后的UV–vis光譜。插圖顯示c-scFv@AuNPs對(duì)不同ADA濃度的檢測(cè)溶液顏色變化，以及1—90 AU/mL范圍內(nèi)A542 nm與ADA濃度的關(guān)系圖。

CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs具有良好選擇性并可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定量檢測(cè)

考慮到生物體系十分復(fù)雜，研究進(jìn)一步評(píng)估CP1.1@AuNPs對(duì)ADL以及c-scFv@AuNPs對(duì)ADA的特異性。研究選擇12種臨床常用mAb以及IgG、IgA、IgE和IgM作為潛在干擾物，包括3種抗PD-1 mAb，即帕博利珠單抗（pembrolizumab，PEM）、替雷利珠單抗（tislelizumab，TIS）、納武利尤單抗（nivolumab，NIV）；2種TNF-α抑制劑，即ADL、英夫利昔單抗（infliximab，IFX）；3種EGFR抑制劑，即貝伐珠單抗（bevacizumab，BEV）、西妥昔單抗（cetuximab，CET）、尼妥珠單抗（nimotuzumab，NIM）；以及1種HER2抑制劑維迪西妥單抗（disitamab，DIS）。每種mAb以100 μg/mL加入CP1.1@AuNPs或c-scFv@AuNPs溶液，并監(jiān)測(cè)吸光度變化。

結(jié)果顯示，CP1.1@AuNPs僅對(duì)ADL產(chǎn)生響應(yīng)，其他mAb未引起明顯UV吸收變化，說(shuō)明CP1.1@AuNPs可特異性響應(yīng)ADL。同樣，c-scFv@AuNPs僅在ADA存在時(shí)吸光度發(fā)生明顯改變，證實(shí)其對(duì)ADA具有特異性。重要的是，僅含ADL或ADA的溶液出現(xiàn)明顯顏色變化，分別由粉紅色轉(zhuǎn)為淡紫色、由紅色轉(zhuǎn)為紫色。這進(jìn)一步證明CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs分別對(duì)ADL和ADA具有較高特異性。

為進(jìn)一步考察其檢測(cè)能力，研究開展UV滴定實(shí)驗(yàn)。對(duì)于CP1.1@AuNPs，隨著ADL濃度從0升高至30 μg/mL，526 nm處吸收峰逐漸降低。在該濃度范圍內(nèi)，A526 nm與ADL濃度呈良好線性關(guān)系，檢測(cè)限（limit of detection，LOD）估計(jì)為0.45 μg/mL。同時(shí)，檢測(cè)溶液顏色隨ADL濃度升高由粉紅色逐漸轉(zhuǎn)為淡紫色，最終趨于透明，便于肉眼觀察ADL水平。值得注意的是，所有測(cè)量均可在混合后1分鐘內(nèi)完成，提示CP1.1@AuNPs對(duì)ADL具有快速響應(yīng)能力。

對(duì)于c-scFv@AuNPs，隨著ADA濃度升高，542 nm處吸光度逐漸降低并略有藍(lán)移。在1—90 AU/mL范圍內(nèi)，A542 nm與ADA濃度呈良好線性關(guān)系，線性方程為Y=?0.003766X+0.6715（R2=0.9831），LOD估計(jì)為0.89 AU/mL。溶液顏色也隨ADA濃度增加由紅色變?yōu)樽仙＿@些結(jié)果表明，c-scFv@AuNPs可根據(jù)ADA濃度產(chǎn)生UV吸收變化，適合用于ADA高靈敏定量分析。

基于二者對(duì)ADL和ADA的良好響應(yīng)性能，研究進(jìn)一步評(píng)估其在臨床血清樣本中的檢測(cè)能力。考慮到血清背景噪聲和基質(zhì)效應(yīng)可能造成干擾，研究建立了改良檢測(cè)流程，用于準(zhǔn)確量化血清中的ADL和ADA。為模擬臨床條件，研究向正常血清中加入不同濃度ADL，并與CP1.1@AuNPs孵育后檢測(cè)吸光度。結(jié)果顯示，當(dāng)血清中ADL濃度從0升至30 μg/mL時(shí)，526 nm處吸收峰按比例降低，ADL濃度與吸光度之間具有強(qiáng)線性相關(guān)，線性方程為Y=?0.003729X+0.5200（R2=0.9951）。這證實(shí)CP1.1@AuNPs可在人體血清中準(zhǔn)確定量ADL，動(dòng)態(tài)范圍適合臨床檢測(cè)。

對(duì)于ADA定量，血清中ADA濃度在1—90 AU/mL范圍內(nèi)升高時(shí)，530 nm處UV吸收峰逐漸下降，并表現(xiàn)出良好線性關(guān)系。線性方程為Y=?0.001319X+0.4122（R2=0.9925），說(shuō)明c-scFv@AuNPs可有效用于血清中ADA定量檢測(cè)。

隨后，研究將CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs用于接受ADL治療患者的血清樣本檢測(cè)。結(jié)果顯示，納米顆粒檢測(cè)方法與傳統(tǒng)ELISA結(jié)果高度相關(guān)，ADL和ADA檢測(cè)的相關(guān)系數(shù)分別為0.9921和0.9936。與其他已報(bào)道ADL檢測(cè)方法相比，該方法具有更好的臨床相關(guān)性、更低檢測(cè)限、更快響應(yīng)速度和更簡(jiǎn)便操作。上述結(jié)果說(shuō)明，CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs可可靠檢測(cè)臨床血清樣本中的ADL和ADA，為床旁檢測(cè)（point-of-care，POC）分析提供實(shí)用準(zhǔn)確工具，也可用于評(píng)估ADL和ADA血藥水平，支持個(gè)體化精準(zhǔn)治療干預(yù)。

圖5：使用功能化AuNPs進(jìn)行血清樣本分析。（a）所開發(fā)的基于功能化AuNPs的ADL和ADA檢測(cè)流程與傳統(tǒng)ELISA方法之間的示意性比較，由BioRender繪制。（b）CP1.1@AuNPs（56 μg/mL）與血清中不同濃度ADL孵育后的UV–vis光譜。（c）0.5—30 μg/mL范圍內(nèi)A526 nm與ADL濃度的校準(zhǔn)曲線。（d）采用Passing–Bablok回歸分析比較本研究UV–vis檢測(cè)法與商業(yè)試劑盒在ADL定量中的方法準(zhǔn)確性；p表示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。（e）c-scFv@AuNPs（0.5 ng/mL）與血清中不同濃度ADA孵育后的UV–vis光譜。（f）1—90 AU/mL范圍內(nèi)A530 nm與ADA濃度的校準(zhǔn)曲線。（g）采用Passing–Bablok回歸分析比較本研究UV–vis檢測(cè)法與商業(yè)試劑盒在ADA定量中的方法準(zhǔn)確性；p表示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

ADL和ADA動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)可輔助AS患者個(gè)體化治療優(yōu)化

強(qiáng)直性脊柱炎（AS）是一種慢性自身免疫性疾病，通常需要長(zhǎng)期抗炎治療，ADL是最常用的一線生物制劑之一。ASDAS常用于臨床評(píng)估疾病活動(dòng)度和治療效果。根據(jù)ASDAS-C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)分≥2.1提示高疾病活動(dòng)度，1.3≤評(píng)分<2.1提示低疾病活動(dòng)度，評(píng)分<1.3提示疾病不活動(dòng)。

然而，臨床實(shí)踐中可見部分患者即使ASDAS評(píng)分提示低活動(dòng)度或不活動(dòng)，仍持續(xù)存在疼痛、疲乏等癥狀。研究團(tuán)隊(duì)既往研究也提示，一些ASDAS評(píng)分較低的AS患者仍可檢測(cè)出ADA陽(yáng)性，并需要使用鎮(zhèn)痛或助眠藥物。這可能與藥物濃度不足或ADA觸發(fā)免疫反應(yīng)有關(guān)。因此，ADA檢測(cè)可能成為評(píng)價(jià)ADL療效的重要補(bǔ)充，為臨床醫(yī)生在傳統(tǒng)疾病活動(dòng)度評(píng)分之外提供基于生物標(biāo)志物的參考。

本研究共收集35份AS臨床樣本，其中33例獲得ASDAS-CRP評(píng)分，另2例因缺少CRP數(shù)據(jù)而無(wú)法計(jì)算。結(jié)果顯示，54.3%患者（n=19）ASDAS-CRP<1.3，屬于疾病不活動(dòng)；20%患者（n=7）ASDAS-CRP≥2.1，屬于高疾病活動(dòng)度；其余7例為低疾病活動(dòng)度。

隨后，研究采用本研究建立的CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs系統(tǒng)，以及傳統(tǒng)ELISA方法檢測(cè)樣本中的ADL濃度和ADA水平。結(jié)果顯示，回收率分別為80.6%—116.1%和86.7%—116.1%，提示臨床樣本中具有良好準(zhǔn)確性和重復(fù)性。該結(jié)果與傳統(tǒng)ELISA高度一致，相關(guān)系數(shù)分別為0.9921和0.9936。

由于CRP和紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）常用于評(píng)價(jià)炎癥，研究進(jìn)一步比較了不同疾病活動(dòng)度組的這些指標(biāo)。結(jié)果顯示，僅CRP水平在疾病不活動(dòng)組與高活動(dòng)組之間存在顯著差異（p=0.005）。相關(guān)性分析進(jìn)一步顯示，ADA水平與CRP水平呈正相關(guān)，而ASDAS-CRP評(píng)分也與CRP水平相關(guān)。這間接提示，ADA水平可能與ASDAS-CRP評(píng)分相關(guān)，并隨ASDAS-CRP升高而升高。因此，血清ADA水平可能作為評(píng)價(jià)ADL療效的重要補(bǔ)充指標(biāo)，為臨床決策提供生物標(biāo)志物證據(jù)。

基于上述結(jié)果，研究進(jìn)一步開展2年隨訪，利用CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs系統(tǒng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)3例AS患者血清ADL和ADA水平。結(jié)果顯示，不同患者之間以及同一患者不同時(shí)點(diǎn)之間，ADL和ADA水平均存在明顯變化。總體而言，個(gè)體內(nèi)ADL濃度相對(duì)穩(wěn)定或逐漸升高，其中患者1和患者3約為5 μg/mL，患者2約為10—30 μg/mL；相比之下，ADA水平波動(dòng)更明顯。

對(duì)于ADA，檢測(cè)閾值用于區(qū)分樣本為陽(yáng)性或陰性，>10 AU/mL定義為陽(yáng)性，<10 AU/mL定義為陰性。該10 AU/mL閾值基于檢測(cè)方法驗(yàn)證，并符合美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）監(jiān)管指南要求。盡管閾值可能隨檢測(cè)方法，如ELISA或增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL），以及疾病類型不同而變化，但>10 AU/mL這一設(shè)置已在臨床實(shí)踐中使用超過(guò)20年，旨在提供一致且可比的數(shù)據(jù)以支持治療決策，并被“阿達(dá)木單抗抗藥抗體擬議WHO國(guó)際生物參考制劑”推薦。

隨訪顯示，患者1基線ADA陽(yáng)性，患者3為ADA陰性，而患者2在隨訪過(guò)程中由ADA陰性轉(zhuǎn)為ADA陽(yáng)性，提示ADA免疫原性隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)。患者1基線ADA為11.23 AU/mL，同時(shí)使用非甾體抗炎藥（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs），劑量為1.2 g/天；10個(gè)月后NSAIDs劑量增加至4.0 g/天。患者2初始ADA陰性，為4.63 AU/mL，但10個(gè)月后轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，升至21.77 AU/mL。值得注意的是，該患者出現(xiàn)疼痛和睡眠障礙，因此加入中藥改善睡眠和緩解疼痛，提示ADL在緩解難治性疼痛和睡眠障礙方面療效有限。患者3 ADA陰性（<10 AU/mL），除因轉(zhuǎn)氨酶升高使用保肝藥物外，未使用其他附加藥物。

研究同時(shí)收集了3例患者的臨床指標(biāo)。結(jié)果顯示，患者1在2年隨訪期間CRP水平和ASDAS-CRP評(píng)分持續(xù)下降。10個(gè)月后，CRP降至正常范圍（<0.5 ng/mL），ASDAS由低活動(dòng)度轉(zhuǎn)為不活動(dòng)，并保持穩(wěn)定。患者2和患者3在整個(gè)研究期間CRP水平均維持正常，ASDAS-CRP評(píng)分提示疾病不活動(dòng)（<1.3）。然而，值得注意的是，盡管患者2的CRP和ASDAS-CRP顯示臨床改善，其ADA水平仍持續(xù)升高，并伴隨睡眠障礙和疼痛加重。這說(shuō)明ADA水平在臨床療效評(píng)估中具有重要補(bǔ)充價(jià)值。

因此，定期監(jiān)測(cè)血清ADL水平，例如每3—6個(gè)月監(jiān)測(cè)一次，同時(shí)監(jiān)測(cè)ADA水平，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)潛在免疫原性風(fēng)險(xiǎn)十分重要。即使ADL濃度保持穩(wěn)定、藥物暴露充足，患者也可能在某個(gè)時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)ADA突然升高，提示療效下降或治療失敗風(fēng)險(xiǎn)。一旦檢測(cè)到ADA陽(yáng)性，可及早優(yōu)化治療方案，從而提高臨床干預(yù)效率。考慮到TNF抑制劑治療費(fèi)用較高，且患者臨床反應(yīng)差異明顯，ADL個(gè)體化治療策略十分必要，可減少治療不足和過(guò)度治療。為此，研究提出應(yīng)嚴(yán)格開展ADL谷濃度和ADA的治療藥物監(jiān)測(cè)，以優(yōu)化藥物使用、提高療效，并最終改善患者結(jié)局和生活質(zhì)量。

圖6：33例AS患者臨床樣本中ADL和ADA水平評(píng)估。（a）使用CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs檢測(cè)ADL和ADA，用于臨床療效評(píng)估和治療干預(yù)。（b）高活動(dòng)度、低活動(dòng)度和不活動(dòng)AS患者之間CRP、ESR、ADL水平和ADA水平比較。（c）3例AS患者中ADL和ADA水平的圖形化展示。（d、e）3例AS患者常用合并用藥和臨床參數(shù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：在使用Brown–Forsythe檢驗(yàn)確認(rèn)方差齊性后，采用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；p<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

【貢獻(xiàn)】★★★★★

本研究提出了一種新型雙重生物傳感平臺(tái)，可實(shí)現(xiàn)ADL和ADA的同步、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，從而回應(yīng)治療性mAb管理中的關(guān)鍵難題。為解決傳統(tǒng)mAb檢測(cè)中缺乏特異性識(shí)別元件的問(wèn)題，研究開發(fā)了基于F(ab′)2片段的創(chuàng)新正/負(fù)雙向噬菌體展示篩選策略。該方法成功鑒定出高親和力肽CP1，可選擇性識(shí)別ADL，并最大限度減少IgG干擾；SPR驗(yàn)證顯示其KD為7.84 μM。

對(duì)于ADA檢測(cè)，研究采用c-scFv片段作為穩(wěn)定且適應(yīng)性良好的識(shí)別單元。通過(guò)整合這些識(shí)別元件，研究構(gòu)建了兩種基于AuNPs的生物傳感器，即CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs，用于快速、定量檢測(cè)ADL和ADA。將該方法應(yīng)用于接受ADL治療的AS患者血清樣本后，檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)出良好準(zhǔn)確性，并與ELISA結(jié)果高度一致（R2=0.99）。

因此，該體系可用于治療療效的實(shí)時(shí)評(píng)估和個(gè)體化治療優(yōu)化。作者認(rèn)為，這是首個(gè)能夠同步監(jiān)測(cè)ADL和ADA血藥水平的系統(tǒng)，為臨床治療性抗體精準(zhǔn)使用提供了新的策略。需要注意的是，本研究主要聚焦ADL/ADA檢測(cè)平臺(tái)構(gòu)建及AS患者樣本驗(yàn)證，未來(lái)仍需在更大規(guī)模、多中心、不同單抗藥物和不同疾病人群中進(jìn)一步驗(yàn)證其臨床適用性、標(biāo)準(zhǔn)化閾值和長(zhǎng)期治療決策價(jià)值。

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