Phytomedicine (1區(qū)，TOP期刊) I 破解 MASLD 脂質(zhì)堆積困局：長(zhǎng)梗冬青苷靶向 HNRNPA1，打通 PPARα 線粒體 β-氧化軸！

2026年1月30日，蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院Yang Zhou、Jingyun Chi等，聯(lián)合上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院Kun Zhao、杭州第一人民醫(yī)院/西湖大學(xué)醫(yī)學(xué)院Xizhen Zhou、開(kāi)拓生命科技（蘇州）有限公司等，在Phytomedicine（中科院1區(qū)，JCR Q1，Impact Factor=8.3）在線發(fā)表題為 “Pedunculoside ameliorates metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease by targeting HNRNPA1 and modulating PPARα signaling pathway to enhance Mitochondrial Fatty Acid β-Oxidation” 的研究論文。

代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝病（MASLD）是當(dāng)前最常見(jiàn)的慢性肝病之一，其核心病理特征是肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)異常堆積，并可進(jìn)一步進(jìn)展為脂肪性肝炎、纖維化、肝硬化甚至肝癌。目前，MASLD 的治療仍存在明顯不足，除生活方式干預(yù)外，真正能夠覆蓋不同疾病階段且兼具療效和安全性的藥物仍然有限。因此，尋找新的治療分子和新的作用靶點(diǎn)，是 MASLD 研究中的重要方向。

本研究聚焦于一種來(lái)源于鐵冬青樹(shù)皮的天然三萜皂苷 長(zhǎng)梗冬青苷（Pedunculoside，PE）。既往研究提示 PE 具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗炎、降膽固醇等藥理活性，但其是否能夠改善 MASLD，以及背后的分子機(jī)制尚不清楚。作者圍繞這一問(wèn)題，構(gòu)建了游離脂肪酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積模型，并進(jìn)一步使用高脂高膽固醇飲食和高脂飲食誘導(dǎo)的 MASLD 小鼠模型，從細(xì)胞和動(dòng)物兩個(gè)層面系統(tǒng)驗(yàn)證 PE 的治療作用。

研究發(fā)現(xiàn)，PE 能夠顯著減輕肝細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積，降低細(xì)胞內(nèi)總膽固醇和甘油三酯水平；在 MASLD 小鼠中，PE 也能降低體重和肝重，改善肝臟脂肪變性、肝細(xì)胞損傷以及血清 ALT、AST、TC、TG 等異常指標(biāo)。更重要的是，安全性評(píng)價(jià)顯示，PE 未引起明顯主要器官毒性，并表現(xiàn)出較好的血液相容性。這說(shuō)明 PE 不僅具有改善脂質(zhì)代謝紊亂的潛力，也具備進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為 MASLD 候選治療藥物的基礎(chǔ)。

機(jī)制層面，本研究的核心發(fā)現(xiàn)是：PE 不是簡(jiǎn)單地直接激活 PPARα 啟動(dòng)子，而是通過(guò)直接結(jié)合 HNRNPA1，增強(qiáng) PPARα mRNA 穩(wěn)定性，從而上調(diào) PPARα 信號(hào)通路，促進(jìn)線粒體脂肪酸 β-氧化。 PPARα 是調(diào)控脂肪酸氧化的重要轉(zhuǎn)錄因子，其下游包括 CPT2、ACADM、ACADL 等脂肪酸 β-氧化相關(guān)關(guān)鍵酶。作者通過(guò)轉(zhuǎn)錄組、脂質(zhì)組聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，PE 處理后 PPAR 信號(hào)通路被顯著激活，肉堿及相關(guān)代謝物升高，甘油三酯和部分游離脂肪酸下降，提示 PE 主要通過(guò)促進(jìn)脂肪酸分解和氧化來(lái)緩解肝臟脂質(zhì)堆積。

為了進(jìn)一步尋找 PE 的直接靶點(diǎn)，作者綜合運(yùn)用了 CETSA-MS、RNA pull-down-MS、DARTS、CETSA、SPR、分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬等多種技術(shù)。結(jié)果顯示，HNRNPA1 是 PE 的直接結(jié)合蛋白，也是連接 PE 與 PPARα mRNA 穩(wěn)定性的關(guān)鍵分子。HNRNPA1 作為一種 RNA 結(jié)合蛋白，可以結(jié)合 PPARα mRNA 并提高其穩(wěn)定性；PE 與 HNRNPA1 結(jié)合后，進(jìn)一步增強(qiáng) HNRNPA1 對(duì) PPARα mRNA 的穩(wěn)定作用，從而提高 PPARα 表達(dá)并促進(jìn)脂肪酸 β-氧化。ScienceDirect 頁(yè)面也將“HNRNPA1 首次被報(bào)道可直接結(jié)合并穩(wěn)定 PPARα mRNA”列為本文亮點(diǎn)之一。

最關(guān)鍵的驗(yàn)證來(lái)自 HNRNPA1 敲除模型。研究顯示，一旦敲除 HNRNPA1，PE 對(duì) MASLD 的保護(hù)作用基本消失：小鼠體重、肝重、血脂指標(biāo)、肝損傷指標(biāo)、組織病理改變以及脂肪酸 β-氧化相關(guān)酶活性均不能被 PE 有效改善。這一結(jié)果說(shuō)明，HNRNPA1 并不是旁觀者，而是 PE 發(fā)揮抗 MASLD 作用所必需的核心靶點(diǎn)。換言之，本文建立了一條較完整的作用鏈條：
PE → HNRNPA1 → PPARα mRNA 穩(wěn)定性增強(qiáng) → PPARα 信號(hào)激活 → 線粒體脂肪酸 β-氧化增強(qiáng) → 肝臟脂質(zhì)堆積減少 → MASLD 緩解。

這項(xiàng)研究的創(chuàng)新性主要體現(xiàn)在三個(gè)方面。第一，它將天然產(chǎn)物 PE 與 MASLD 治療聯(lián)系起來(lái)，證明 PE 在細(xì)胞和動(dòng)物模型中均具有明確的脂質(zhì)代謝改善作用。第二，它發(fā)現(xiàn)了一個(gè)此前在 MASLD 治療機(jī)制中未被充分認(rèn)識(shí)的靶點(diǎn) HNRNPA1，并證明其能夠通過(guò)穩(wěn)定 PPARα mRNA 調(diào)控脂肪酸 β-氧化。第三，研究并未停留在表型觀察，而是通過(guò)多組學(xué)分析、靶點(diǎn)結(jié)合驗(yàn)證和基因敲除模型，形成了從“藥效—靶點(diǎn)—機(jī)制—體內(nèi)功能必要性”的完整證據(jù)鏈。

總體而言，本文揭示了 PE 改善 MASLD 的新機(jī)制：PE 通過(guò)直接靶向 HNRNPA1，穩(wěn)定 PPARα mRNA，進(jìn)而增強(qiáng)線粒體脂肪酸 β-氧化，最終減輕肝臟脂質(zhì)沉積和代謝損傷。該研究不僅提示 PE 可能成為 MASLD 的潛在天然藥物候選物，也將 HNRNPA1–PPARα 調(diào)控軸提出為代謝性肝病治療的新機(jī)制靶點(diǎn)。作者在結(jié)論中也指出，利用天然活性化合物作為分子探針，有助于發(fā)現(xiàn) MASLD 的新型治療靶點(diǎn)，而 HNRNPA1 正是這一框架下值得進(jìn)一步關(guān)注的候選分子。

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【摘要】

背景：代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝病（MASLD）已成為重要的全球健康挑戰(zhàn)，迫切需要開(kāi)發(fā)療效更好、安全性更高的新型治療藥物。長(zhǎng)梗冬青苷（Pedunculoside，PE）是一種天然三萜皂苷，已顯示出良好的脂質(zhì)調(diào)節(jié)作用。然而，PE 在 MASLD 中發(fā)揮作用的具體機(jī)制仍不明確。

目的：探討 PE 的抗 MASLD 作用，并闡明其通過(guò)靶向異質(zhì)性核糖核蛋白 A1（HNRNPA1）并調(diào)控下游 PPARα 通路發(fā)揮作用的新機(jī)制。

方法：本研究在原代小鼠肝細(xì)胞中，并在高脂高膽固醇飲食（HFHC）和高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)的 MASLD 小鼠模型中，評(píng)價(jià) PE 的治療潛力。研究采用多組學(xué)和多技術(shù)聯(lián)合策略，包括生化檢測(cè)、組織病理學(xué)分析、轉(zhuǎn)錄組和脂質(zhì)組分析，并通過(guò)藥物親和反應(yīng)靶標(biāo)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)（DARTS）、細(xì)胞熱轉(zhuǎn)變實(shí)驗(yàn)（CETSA）、表面等離子體共振（SPR）、分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬以及 HNRNPA1 敲除模型驗(yàn)證靶標(biāo)結(jié)合關(guān)系。

結(jié)果：PE 顯著改善了 MASLD 模型中的關(guān)鍵代謝異常和組織病理特征。機(jī)制上，PE 可直接結(jié)合 HNRNPA1，而 HNRNPA1 此前尚未被報(bào)道為 MASLD 治療中的靶點(diǎn)。這種相互作用增強(qiáng)了 PPARα mRNA 的穩(wěn)定性，從而激活脂肪酸 β-氧化。重要的是，HNRNPA1 敲除會(huì)消除 PE 的有益作用，證實(shí) PE–HNRNPA1–PPARα 軸在體內(nèi)發(fā)揮功能所必需。

結(jié)論：本研究揭示了 MASLD 中一條新的治療調(diào)控軸：PE 通過(guò)直接結(jié)合 HNRNPA1 增強(qiáng) PPARα mRNA 的穩(wěn)定性，進(jìn)而上調(diào)脂肪酸 β-氧化。該發(fā)現(xiàn)不僅表明 PE 是 MASLD 的潛在治療候選藥物，也提示 HNRNPA1–PPARα 調(diào)控通路可能成為治療代謝性肝病的重要機(jī)制靶點(diǎn)。

01

研究背景及科學(xué)問(wèn)題

代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝病（MASLD）是一組慢性肝臟疾病，其主要特征是肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)度蓄積，即肝脂肪變性。隨著肥胖、2 型糖尿病和代謝綜合征流行率不斷上升，MASLD 的全球患病率也迅速增加，并已成為全球最常見(jiàn)的慢性肝病。近期流行病學(xué)研究估計(jì)，全球約 38% 的成年人受到 MASLD 影響，顯示出其重要的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。在中國(guó)，MASLD 已超過(guò)慢性乙型肝炎，成為慢性肝病的首要原因，說(shuō)明其已經(jīng)成為重大的國(guó)家健康挑戰(zhàn)。

臨床上，MASLD 可沿著連續(xù)病程進(jìn)展，從單純脂肪變性，即代謝功能障礙相關(guān)脂肪肝（MASL），進(jìn)一步發(fā)展為更嚴(yán)重的階段，包括代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎（MASH）、進(jìn)行性纖維化、肝硬化以及肝細(xì)胞癌（HCC）。這種疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)凸顯了早期發(fā)現(xiàn)和早期干預(yù)的重要性，以降低晚期 MASLD 相關(guān)的發(fā)病率和死亡率。在這一背景下，Resmetirom 近期成為首個(gè)也是目前唯一一個(gè)獲得 FDA 批準(zhǔn)、專(zhuān)門(mén)用于成人非肝硬化性 MASH 且伴中重度肝纖維化的藥物。然而，其使用仍需與飲食、運(yùn)動(dòng)等生活方式干預(yù)相結(jié)合，并存在胃腸道不適等不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于 MASLD 的其他階段，治療選擇仍然有限，主要依賴(lài)生活方式改變以及降脂藥、胰島素增敏劑和保肝藥等間接藥物支持，但這些治療的療效并不理想。因此，MASLD 管理中仍存在持續(xù)的治療空白，迫切需要開(kāi)發(fā)療效更好、安全性更高的新型藥物。

MASLD 的發(fā)病機(jī)制本質(zhì)上與脂肪酸代謝紊亂密切相關(guān)，其特點(diǎn)是肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯（TG）過(guò)度積累。脂肪酸 β-氧化是關(guān)鍵代謝過(guò)程，主要通過(guò)兩個(gè)相互聯(lián)系的途徑進(jìn)行：線粒體 β-氧化和過(guò)氧化物酶體氧化。在這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 α（PPARα）處于核心地位。PPARα 是一種核受體，是脂肪酸 β-氧化的主要調(diào)控因子。作為肝臟富集表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，PPARα 通過(guò)上調(diào)參與脂肪酸分解代謝的關(guān)鍵酶表達(dá)，協(xié)調(diào)脂肪酸氧化代謝，其中包括肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶 1A（CPT1A）和酰基輔酶 A 氧化酶 1（ACOX1）。值得注意的是，MASLD 進(jìn)展與 PPARα 表達(dá)顯著下調(diào)有關(guān)，這會(huì)導(dǎo)致脂肪酸 β-氧化相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平受到抑制。該代謝紊亂會(huì)削弱脂肪酸氧化能力，造成有毒脂質(zhì)積累，并進(jìn)一步酯化為甘油三酯，直接推動(dòng)肝脂肪變性進(jìn)展。

近年來(lái)，天然生物活性化合物及其衍生物作為 MASLD 輔助治療方式受到廣泛關(guān)注，可為生活方式干預(yù)和常規(guī)治療提供補(bǔ)充獲益。由于具有多靶點(diǎn)作用機(jī)制、較好的療效以及良好的安全性，天然生物活性化合物成為緩解 MASLD 的有前景方向。例如，咖啡因可通過(guò)恢復(fù)肝臟 Dusp9 表達(dá)改善代謝相關(guān)脂肪性肝炎，燈盞花素則可通過(guò)抑制 TGF-β 激活激酶 1 依賴(lài)性信號(hào)通路減輕 MASH。越來(lái)越多證據(jù)顯示，天然生物活性化合物在 MASLD 治療中具有潛力，尤其體現(xiàn)在調(diào)節(jié)脂肪酸 β-氧化及相關(guān)代謝通路方面。

九必應(yīng)，即 Ilicis Rotundae Cortex，來(lái)源于鐵冬青（Ilex rotunda Thunb.）的樹(shù)皮，已被《中國(guó)藥典》正式收載。傳統(tǒng)上，九必應(yīng)因具有抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)水液代謝等作用，被用于治療感冒、發(fā)熱、急慢性肝炎、急性胃腸炎和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。長(zhǎng)梗冬青苷（PE）是一種從鐵冬青干燥樹(shù)皮中分離得到的三萜皂苷（C36H58O10），具有多種藥理活性，包括抗炎、抗腫瘤、降膽固醇和抗高血壓作用。既往研究表明，PE 能顯著影響脂質(zhì)代謝，可調(diào)節(jié) PPARγ、C/EBPα 和 SREBP-1 的表達(dá)，并在 MDI 誘導(dǎo)的 3T3-L1 細(xì)胞中抑制 AMPK 磷酸化。然而，PE 緩解 MASLD 的具體機(jī)制仍不清楚。

本研究假設(shè)，PE 通過(guò)直接作用于異質(zhì)性核糖核蛋白 A1（HNRNPA1）影響 PPARα mRNA 的穩(wěn)定性，從而增強(qiáng)脂肪酸 β-氧化，并最終改善 MASLD。我們?cè)诩?xì)胞模型和動(dòng)物模型中評(píng)估 PE 對(duì) MASLD 的影響，并進(jìn)一步闡明 PE 對(duì) HNRNPA1–PPARα 軸的調(diào)控作用。本研究結(jié)果揭示了 PE 在 MASLD 中發(fā)揮作用的潛在機(jī)制和功能意義，為開(kāi)發(fā)用于治療 MASLD 的天然藥物化合物提供了新的靶點(diǎn)和思路。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點(diǎn)

PE 顯著改善原代小鼠肝細(xì)胞中的生理表型

本研究首先在 MASLD 樣條件下，于原代小鼠肝細(xì)胞中評(píng)估 PE 的治療潛力。研究使用游離脂肪酸（FFA）刺激肝細(xì)胞以誘導(dǎo)脂質(zhì)積累，并在有無(wú) FFA 處理的條件下，采用 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 0–400 μM PE 處理后的細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，在 0–100 μM 濃度范圍內(nèi)，PE 未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。基于這一結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇 50 μM 和 100 μM PE 進(jìn)行研究。

隨后，尼羅紅染色分析顯示，在 FFA 處理的細(xì)胞中，PE 給藥后脂質(zhì)積累呈劑量依賴(lài)性下降。此外，50 μM 和 100 μM PE 處理均顯著降低了總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平。總體來(lái)看，這些結(jié)果表明，PE 能夠有效減輕 FFA 誘導(dǎo)的原代小鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)積累。

圖 1. PE 對(duì) FFA 處理的原代小鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)積累的影響。
（A）PE 的化學(xué)結(jié)構(gòu)。（B）采用尼羅紅染色評(píng)估經(jīng)或未經(jīng) PE 處理的 FFA 誘導(dǎo)原代小鼠肝細(xì)胞中的脂滴沉積。（C）尼羅紅染色下 FFA 誘導(dǎo)原代小鼠肝細(xì)胞脂滴沉積的統(tǒng)計(jì)分析。（D–E）PE 對(duì) TC（D）和 TG（E）的影響。數(shù)據(jù)以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示（n = 3）。*，p < 0.001；**，p < 0.0001。

PE 在小鼠模型中顯著緩解 MASLD 相關(guān)生理表現(xiàn)

為評(píng)估 PE 在 MASLD 中的治療潛力，研究采用兩種飲食誘導(dǎo)的小鼠模型。在 HFHC 模型中，小鼠接受 16 周高脂高膽固醇飲食，并在第 4 周后開(kāi)始口服 PE（15 mg/kg 或 30 mg/kg），持續(xù) 12 周。與 MASLD 模型組相比，兩種劑量的 PE 均顯著降低體重和肝重，并改善肝臟大體形態(tài)。模型組小鼠肝臟的組織學(xué)分析，即 H&E 染色和油紅 O（ORO）染色，顯示明顯脂滴積累、肝細(xì)胞腫脹和壞死，而 PE 處理后這些改變均得到改善。此外，模型組升高的血清 ALT、AST、TC 和 TG 水平，在 PE 給藥后明顯下降。

在第二種模型中，小鼠接受 20 周高脂飲食，并同樣在第 4 周后開(kāi)始 PE 處理（15 mg/kg 或 30 mg/kg）。與 HFHC 模型結(jié)果一致，PE 顯著降低體重和肝重，并改善肝臟形態(tài)。組織學(xué)結(jié)果同樣顯示，PE 可改善脂質(zhì)積累和肝細(xì)胞損傷，并顯著降低血清 ALT、AST、TC 和 TG 水平。

綜上，這些結(jié)果表明，PE 能夠有效減緩小鼠 MASLD 進(jìn)展，具體表現(xiàn)為降低體重和肝重、改善肝臟組織學(xué)改變，并使肝損傷和脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)血清指標(biāo)趨于正常。

圖 2. PE 改善 HFHC 誘導(dǎo)的 MASLD 小鼠肝脂肪變性。
（A）HFHC 誘導(dǎo)的 MASLD 小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)流程圖。（B–D）NCD、NCD+Vehicle、HFHC、HFHC+Vehicle、HFHC+PE（15 mg/kg）、HFHC+PE（30 mg/kg）和 HFHC+Fenofibrate（10 mg/kg）各組小鼠的體重（B）、肝重（C）和肝臟大體形態(tài)（D）。（E–F）上述各組小鼠肝臟切片 H&E 和 ORO 染色代表圖及 ORO 染色統(tǒng)計(jì)分析。（G–J）上述各組小鼠血清 ALT（G）、AST（H）、TC（I）和 TG（J）水平。數(shù)據(jù)以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示（n = 6）。****，p < 0.0001；ns，p > 0.05。

PE 具有良好的血液相容性，且未造成嚴(yán)重器官毒性

為進(jìn)一步評(píng)估 PE 治療的安全性，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，研究進(jìn)行了組織病理學(xué)檢查以及心臟和腎臟功能的生化分析。臨床觀察顯示，NCD、NCD+Vehicle、HFHC、HFHC+Vehicle、HFHC+PE(l)、HFHC+PE(H) 和 HFHC+Fenofibrate 各組之間未見(jiàn)明顯差異，HFD 模型中相應(yīng)各組之間也未見(jiàn)明顯差異。此外，對(duì)心臟、脾臟、肺和腎臟等關(guān)鍵器官進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)估后發(fā)現(xiàn)，在 HFHC 和 HFD 兩種模型的各組之間均無(wú)顯著差異。

為進(jìn)一步研究 PE 可能導(dǎo)致的毒性，研究檢測(cè)了腎功能和心肌損傷相關(guān)生物標(biāo)志物。結(jié)果顯示，在兩種飲食模型中，各組尿素（UREA）、肌酐（CREA）和乳酸脫氫酶（LDH）水平均無(wú)顯著差異，提示 PE 未造成主要器官損傷。

此外，研究還進(jìn)行了溶血實(shí)驗(yàn)以評(píng)估血液相容性。結(jié)果顯示，蒸餾水組作為陽(yáng)性對(duì)照，紅細(xì)胞發(fā)生明顯裂解，紅細(xì)胞懸液呈現(xiàn)清晰紅色。相比之下，生理鹽水組作為陰性對(duì)照，與空白血清組、載體血清組、低劑量 PE 血清組和高劑量 PE 血清組在 450–700 nm 吸光度范圍內(nèi)均未觀察到差異。這些結(jié)果說(shuō)明，低劑量和高劑量 PE 均具有良好的血液相容性。

PE 通過(guò)調(diào)控 PPARα 促進(jìn)脂肪酸 β-氧化

為探究 PE 延緩 MASLD 進(jìn)展的潛在機(jī)制，研究進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和脂質(zhì)組分析。RNA 測(cè)序結(jié)果顯示，PE 處理后共有 713 個(gè)基因上調(diào)、1193 個(gè)基因下調(diào)。KEGG 和 Wiki 通路富集分析顯示，PPAR 信號(hào)通路顯著激活，其中 PPARα、ACAA1A、FABP1、CPT2、ACADM 和 ACADL 等關(guān)鍵基因出現(xiàn)明顯表達(dá)變化。

脂質(zhì)組學(xué)分析顯示，PE 誘導(dǎo)了廣泛的代謝重編程，共有 153 種代謝物上調(diào)、190 種代謝物下調(diào)。熱圖分析顯示，脂質(zhì)譜發(fā)生明顯改變：肉堿及相關(guān)代謝物升高，而游離脂肪酸 18:0 和甘油三酯降低。這一變化模式與 SMPDB 通路分析結(jié)果一致，后者顯示參與長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸線粒體 β-氧化的脂質(zhì)種類(lèi)顯著富集。在差異最顯著的代謝物中，VIP 值排名前 20 的代謝物中有 8 個(gè)與脂肪酸 β-氧化有關(guān)，排名前 50 的代謝物中有 10 個(gè)與脂肪酸 β-氧化有關(guān)。

整合多組學(xué)分析顯示，脂肪酸氧化相關(guān)基因與肉堿、TC 和 TG 等關(guān)鍵脂質(zhì)代謝物之間存在顯著相關(guān)性。值得注意的是，在 PPAR 通路中，PPARα、CPT2、ACADM 和 ACADL 與肉堿及 TG 水平呈現(xiàn)強(qiáng)相關(guān)性。

綜上，這些結(jié)果提示，PE 可能通過(guò)增強(qiáng)線粒體脂肪酸 β-氧化來(lái)緩解 MASLD 進(jìn)展。基于轉(zhuǎn)錄組和脂質(zhì)組整合數(shù)據(jù)，研究認(rèn)為 PE 主要通過(guò)上調(diào) PPAR 通路并促進(jìn)脂肪酸氧化來(lái)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。

圖 3. PE 增強(qiáng)脂肪酸 β-氧化。
（A）轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果火山圖。（B）RNA 測(cè)序 KEGG 富集通路圖。（C）脂質(zhì)組學(xué)熱圖。（D）VIP 值最高的前 20 個(gè)差異表達(dá)脂質(zhì)柱狀圖。（E）轉(zhuǎn)錄組與脂質(zhì)組整合分析相關(guān)性熱圖。（F）關(guān)鍵 PPAR 通路基因與脂質(zhì)組學(xué)的整合相關(guān)性分析。

β-羥基丁酸（β-OHB）是脂肪酸 β-氧化過(guò)程中產(chǎn)生的關(guān)鍵中間代謝物。為評(píng)估脂肪酸 β-氧化水平，研究檢測(cè)了 THLE-2 細(xì)胞中的氧耗率（OCR）、β-OHB 水平和 PPARα 表達(dá)。PE 處理顯著增加 OCR 和 β-OHB 生成。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，PPAR 通路相關(guān)基因表達(dá)升高，包括 PPARα、CPT2、ACADM 和 ACADL，其中 CPT2、ACADM 和 ACADL 是 β-氧化關(guān)鍵酶，而 PPARα 是主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。與此一致，PE 增強(qiáng)了 PPARα 的 mRNA 和蛋白表達(dá)。使用 shRNA 敲低 PPARα 后，PE 誘導(dǎo)的 β-OHB 增加被削弱，證實(shí) PPARα 在其中具有介導(dǎo)作用。

研究進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)線粒體膜電位（Δψm）、ATP 水平、活性氧（ROS）生成以及 β-氧化酶活性來(lái)評(píng)估線粒體功能。與 FFA 處理細(xì)胞相比，PE 處理以劑量依賴(lài)方式升高 Δψm 和 ATP 水平，降低 ROS，并提高 CPT2、ACADM 和 ACADL 活性。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也觀察到類(lèi)似結(jié)果：在 HFHC 和 HFD 飲食小鼠中，PE 給藥增強(qiáng)了 ATP 水平和 β-氧化酶活性。值得注意的是，在 PPARα 敲低細(xì)胞中，PE 未能恢復(fù)酶活性，進(jìn)一步支持該過(guò)程依賴(lài) PPARα 調(diào)控。

總體來(lái)看，這些結(jié)果表明，PE 通過(guò)上調(diào) PPARα 及其下游酶網(wǎng)絡(luò)，增強(qiáng)線粒體脂肪酸 β-氧化。

圖 4. PE 通過(guò)調(diào)控 PPARα 增強(qiáng)脂肪酸 β-氧化。
（A）對(duì)照組和 PE（100 μM）組的 OCR 結(jié)果。（B）對(duì)照組和 PE（100 μM）組的 β-OHB 水平。（C）THLE-2 細(xì)胞中 PPARα 的 mRNA 水平。（D）對(duì)照組和 PE（100 μM）組中 PPARα 的 Western blot 及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。（E）對(duì)照組、PE（100 μM）組、shPPARα 組和 shPPARα+PE（100 μM）組的 β-OHB 水平。（F–H）對(duì)照組、FFA 組、FFA+PE（50 μM）組和 FFA+PE（100 μM）組中的線粒體膜電位（Δψm）檢測(cè)結(jié)果（F）、ATP 檢測(cè)結(jié)果（G）和 ROS 檢測(cè)結(jié)果（H）。（I–K）對(duì)照組、FFA 組、FFA+PE（50 μM）組和 FFA+PE（100 μM）組 THLE-2 細(xì)胞中 CPT2（I）、ACADM（J）和 ACADL（K）的 mRNA 水平。（L–N）對(duì)照組、PE（100 μM）組、shPPARα 組和 shPPARα+PE（100 μM）組 THLE-2 細(xì)胞中 CPT2（L）、ACADM（M）和 ACADL（N）的 mRNA 水平。（O）示意圖顯示 PE 通過(guò)調(diào)控 PPARα 影響 CPT2、ACADM 和 ACADL 的轉(zhuǎn)錄水平。數(shù)據(jù)以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示（n = 3）。，P < 0.05；，P < 0.01；，P < 0.001；****，P < 0.0001；ns，P > 0.05。

HNRNPA1 是 PE 的直接靶點(diǎn)

在觀察到 PE 上調(diào) PPARα 蛋白和 mRNA 水平后，研究首先假設(shè) PE 可能增強(qiáng) PPARα 的轉(zhuǎn)錄活性。然而，THLE-2 細(xì)胞中的雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，PE 對(duì) PPARα 啟動(dòng)子活性無(wú)顯著影響。由此，研究轉(zhuǎn)而考慮另一種機(jī)制，即 PE 可能調(diào)節(jié) PPARα mRNA 的穩(wěn)定性。為驗(yàn)證這一點(diǎn)，研究進(jìn)行了 mRNA 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估 PE 對(duì) PPARα mRNA 降解的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PE 處理的 THLE-2 細(xì)胞中 PPARα mRNA 在 12 小時(shí)內(nèi)的降解速度顯著減慢，提示 PE 可能增強(qiáng) PPARα mRNA 的穩(wěn)定性。為進(jìn)一步探究這種穩(wěn)定化作用是否源于直接結(jié)合，研究采用 SPR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) PE 與 PPARα RNA 之間的結(jié)合親和力。結(jié)果顯示，PE 與 PPARα mRNA 之間不存在直接結(jié)合。

為鑒定 PE 調(diào)控 PPARα 的蛋白靶點(diǎn)，研究對(duì) PE 處理的 THLE-2 細(xì)胞進(jìn)行了 CETSA-MS，同時(shí)以 PPARα mRNA 為誘餌進(jìn)行了 RNA pull-down-MS。Coomassie 染色凝膠條帶中的蛋白和 RNA pull-down 洗脫產(chǎn)物均通過(guò) LC-MS 進(jìn)行分析。在 CETSA-MS 中，在 62℃ 加熱、0–90 μM PE 條件下共鑒定出 176 個(gè)候選相互作用蛋白；RNA pull-down-MS 則鑒定出 100 個(gè) PPARα mRNA 結(jié)合蛋白。兩個(gè)數(shù)據(jù)集中唯一共同出現(xiàn)的蛋白是 HNRNPA1。

隨后，研究通過(guò)多種方法進(jìn)一步驗(yàn)證 PE–HNRNPA1 相互作用。DARTS 結(jié)果顯示，PE 能以劑量依賴(lài)方式保護(hù) HNRNPA1 免受 pronase 消化。CETSA 結(jié)果證實(shí)，與 DMSO 對(duì)照相比，PE 處理裂解液中 HNRNPA1 的熱穩(wěn)定性增強(qiáng)。分子對(duì)接預(yù)測(cè)顯示二者具有較強(qiáng)結(jié)合能力，結(jié)合自由能為 –8.3 kcal/mol，并與 Val、Glu 和 Tyr 殘基形成距離小于 3.5 ? 的氫鍵。分子動(dòng)力學(xué)模擬顯示二者結(jié)合穩(wěn)定，表現(xiàn)為 RMSD 較低且趨于收斂，HNRNPA1 核心結(jié)構(gòu)域 RMSF 降低，回轉(zhuǎn)半徑和溶劑可及表面積保持一致，并在整個(gè)模擬過(guò)程中持續(xù)存在 1–2 個(gè)氫鍵。最后，SPR 進(jìn)一步證實(shí) PE 與 HNRNPA1 之間存在直接且特異性的結(jié)合。

總體而言，這些結(jié)果證明，PE 可在生化和細(xì)胞水平上直接結(jié)合 HNRNPA1。

圖 5. HNRNPA1 是 PE 的直接結(jié)合靶點(diǎn)。
（A）對(duì)照組和 PE（100 μM）組的相對(duì)熒光素酶活性。（B）對(duì)照組和 PE（100 μM）組中 PPARα mRNA 穩(wěn)定性水平。（C）PE 與 PPARα RNA 結(jié)合水平的 SPR 結(jié)果。（D）CETSA-MS 與 RNA Pull-down-MS 的整合分析結(jié)果。（E）THLE-2 細(xì)胞中的 DARTS 結(jié)果。（F）THLE-2 細(xì)胞中的 CETSA 結(jié)果。（G）PE 與 HNRNPA1 的分子對(duì)接結(jié)果。（H–I）分子動(dòng)力學(xué)模擬中的 RMSD（H）和 RMSF（I）結(jié)果。（J）PE 與 HNRNPA1 結(jié)合水平的 SPR 結(jié)果。***，p < 0.001；ns，p > 0.05。

PE 通過(guò)直接結(jié)合 HNRNPA1 調(diào)控 PPARα

為明確 PE 是否通過(guò) HNRNPA1 調(diào)控 PPARα mRNA，研究構(gòu)建了 HNRNPA1 敲低的 THLE-2 細(xì)胞。結(jié)果顯示，在 shHNRNPA1 組中，PPARα 的 mRNA 和蛋白水平均顯著下調(diào)。值得注意的是，在 HNRNPA1 敲低后，PE 上調(diào) PPARα 表達(dá)的能力被消除。此外，β-OHB 含量檢測(cè)顯示，HNRNPA1 敲低降低 β-OHB 水平，而 PE 對(duì) β-OHB 的調(diào)節(jié)作用在 HNRNPA1 敲低后同樣消失。與 shHNRNPA1 組相比，shHNRNPA1+PE（100 μM）組的 Δψm 和細(xì)胞 ATP 水平均顯著降低，而 ROS 生成明顯減少。機(jī)制上，HNRNPA1 的關(guān)鍵作用進(jìn)一步體現(xiàn)在：在 HNRNPA1 敲低細(xì)胞中，PE 介導(dǎo)的三種關(guān)鍵 β-氧化酶 CPT2、ACADM 和 ACADL 的激活完全消失，說(shuō)明 HNRNPA1 在協(xié)調(diào) PE 對(duì)脂肪酸代謝的多重作用中處于核心位置。

綜上，這些發(fā)現(xiàn)表明，PE 通過(guò)直接結(jié)合 HNRNPA1 調(diào)節(jié) PPARα 表達(dá)。

圖 6. PE 通過(guò)直接結(jié)合 HNRNPA1 調(diào)控 PPARα。
（A）對(duì)照組、PE（100 μM）組、shHNRNPA1 組和 shHNRNPA1+PE（100 μM）組中 PPARα 的 mRNA 水平。（B）上述各組中 PPARα 的 Western blot 及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。（C）上述各組的 β-OHB 水平。（D–F）上述各組中的線粒體膜電位（Δψm）檢測(cè)結(jié)果（D）、ATP 檢測(cè)結(jié)果（E）和 ROS 檢測(cè)結(jié)果（F）。（G–I）上述各組中 CPT2（G）、ACADM（H）和 ACADL（I）的 mRNA 水平。（J）示意圖顯示 PE 通過(guò)與 HNRNPA1 相互作用影響 PPARα。數(shù)據(jù)以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示（n = 3）。，p < 0.05；，p < 0.01；，p < 0.001；****，p < 0.0001；ns，p > 0.05。

HNRNPA1 在調(diào)控 PPARα mRNA 穩(wěn)定性中發(fā)揮關(guān)鍵作用

為闡明 HNRNPA1 與 PPARα 之間的關(guān)系，研究首先在 THLE-2 細(xì)胞中調(diào)控 HNRNPA1 表達(dá)。shHNRNPA1 顯著降低 PPARα mRNA 和蛋白水平，而 HNRNPA1 過(guò)表達(dá)則明顯升高二者水平。臨床相關(guān)性方面，對(duì) 206 例 MASLD 患者樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，HNRNPA1 與 PPARα 表達(dá)之間存在強(qiáng)正相關(guān)，進(jìn)一步支持二者之間的功能關(guān)系。此外，研究還在體外模型，即不同濃度 FFA 刺激的 THLE-2 細(xì)胞，以及體內(nèi)模型，即 HFHC 飲食誘導(dǎo)的 MASLD 小鼠肝組織中，對(duì) PPARα 和 HNRNPA1 的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，PPARα 與 HNRNPA1 表達(dá)在體外和體內(nèi)均呈顯著正相關(guān)。

RNA 結(jié)合蛋白（RBP）能夠識(shí)別特定 mRNA 序列或結(jié)構(gòu)，從而調(diào)節(jié) mRNA 的合成、穩(wěn)定性和功能。鑒于 HNRNPA1 作為 RNA 結(jié)合蛋白在 mRNA 穩(wěn)定性和代謝中的已知作用，研究假設(shè) HNRNPA1 可能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控 PPARα。事實(shí)上，PPARα mRNA 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)顯示，敲低 HNRNPA1 會(huì)加速 PPARα mRNA 降解，而過(guò)表達(dá) HNRNPA1 則會(huì)延長(zhǎng)其半衰期。RIP 實(shí)驗(yàn)證實(shí)二者存在直接相互作用，與 IgG 對(duì)照相比，F(xiàn)lag-HNRNPA1 pull-down 中 PPARα mRNA 富集更高。RNA pull-down 實(shí)驗(yàn)表明，HNRNPA1 更傾向于結(jié)合 PPARα mRNA 的正義鏈，且具體結(jié)合區(qū)域位于編碼序列（CDS）區(qū)域。相應(yīng)地，雙熒光素酶報(bào)告活性在 HNRNPA1 敲低后下降，在其過(guò)表達(dá)后增強(qiáng)。

重要的是，PE 處理增強(qiáng)了 HNRNPA1–PPARα mRNA 相互作用，表現(xiàn)為 RIP 實(shí)驗(yàn)中 mRNA 富集增加。此外，PE 能增強(qiáng)對(duì)照細(xì)胞中的熒光素酶活性，但在 HNRNPA1 敲低細(xì)胞中不能發(fā)揮這一作用。

總體而言，這些結(jié)果表明，HNRNPA1 可直接結(jié)合并穩(wěn)定 PPARα mRNA，而 PE 通過(guò)增強(qiáng)這種 RNA–蛋白相互作用促進(jìn) PPARα 表達(dá)。

圖 7. HNRNPA1 調(diào)控 PPARα mRNA 穩(wěn)定性。
（A）對(duì)照組和 shHNRNPA1 組，或?qū)φ战M和 OEHNRNPA1 組中 PPARα 的 mRNA 水平。（B）對(duì)照組和 shHNRNPA1 組中 PPARα 的 Western blot 及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。（C）對(duì)照組和 OEHNRNPA1 組中 PPARα 的 Western blot 及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。（D–F）GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中 MASLD 患者臨床樣本（D）、人 THLE-2 細(xì)胞（E）和 MASLD 小鼠肝臟（F）中 HNRNPA1 與 PPARα 的相關(guān)性分析結(jié)果。（G–H）對(duì)照組和 shHNRNPA1 組（G）或?qū)φ战M和 OEHNRNPA1 組（H）中 PPARα mRNA 穩(wěn)定性水平。（I）IgG 組與 Flag-HNRNPA1 組之間的 RIP 結(jié)果。（J）反義鏈和正義鏈中 HNRNPA1 的 RNA pull-down 結(jié)果。（K）CDS 正義鏈中 HNRNPA1 的 RNA pull-down 結(jié)果。（L）對(duì)照組和 shHNRNPA1 組，或?qū)φ战M和 OEHNRNPA1 組中的相對(duì)熒光素酶活性。（M）對(duì)照組和 PE（100 μM）組中 IgG 與 Flag-HNRNPA1 之間的 RIP 結(jié)果。（N）對(duì)照組、PE（100 μM）組、shHNRNPA1 組和 shHNRNPA1+PE（100 μM）組的相對(duì)熒光素酶活性。數(shù)據(jù)以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示（n = 3）。，p < 0.01；，p < 0.001；***，p < 0.0001；ns，p > 0.05。

PE 的抗 MASLD 作用依賴(lài) HNRNPA1

基于 HNRNPA1 穩(wěn)定 PPARα mRNA 的作用，研究假設(shè) HNRNPA1 敲除會(huì)破壞這一調(diào)控軸并加速 MASLD 進(jìn)展。為明確 PE 的抗 MASLD 作用是否由 HNRNPA1 介導(dǎo)，研究利用 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)刪除第 2–8 號(hào)外顯子，構(gòu)建了 HNRNPA1 敲除（HNRNPA1KO）小鼠，這些外顯子區(qū)域涵蓋第 1 號(hào)外顯子的起始密碼子和第 10 號(hào)外顯子的終止密碼子。

在第一組實(shí)驗(yàn)中，研究通過(guò) 16 周 HFHC 飲食在野生型和 HNRNPA1KO 小鼠中誘導(dǎo) MASLD。在 HNRNPA1KO 小鼠中，PE 干預(yù)未能改善 MASLD 表型，包括體重、肝重、血清 ALT、AST、TC 和 TG 水平以及組織病理學(xué)特征，即 H&E 和 ORO 染色結(jié)果。此外，在 HFHC 模型中，HNRNPA1 缺失消除了 PE 誘導(dǎo)的 ATP 增加和 β-氧化酶 CPT2、ACADM、ACADL 活性增強(qiáng)。

在第二組實(shí)驗(yàn)中，小鼠接受 20 周 HFD 飲食。類(lèi)似地，在 HNRNPA1KO 小鼠中，PE 未能緩解 MASLD 相關(guān)指標(biāo)，表現(xiàn)為體重和肝重?zé)o改善，血清生物標(biāo)志物無(wú)改善，組織學(xué)改變無(wú)改善，ATP 水平以及 β-氧化酶活性也未改善。

綜上，這些發(fā)現(xiàn)表明，全身性 HNRNPA1 缺失會(huì)消除 PE 對(duì) MASLD 的保護(hù)作用，說(shuō)明 HNRNPA1 是 PE 發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵介導(dǎo)因子。

圖 8. 在 HFHC 誘導(dǎo)的 MASLD 小鼠中，PE 的抗 MASLD 作用依賴(lài) HNRNPA1。
（A）HFHC 誘導(dǎo)的 HNRNPA1KO MASLD 小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)流程圖。（B–C）WT、WT+PE（30 mg/kg）、HNRNPA1KO 和 HNRNPA1KO+PE（30 mg/kg）各組的體重（B）和肝重（C）。（D）WT、WT+PE（30 mg/kg）、HNRNPA1KO 和 HNRNPA1KO+PE（30 mg/kg）各組肝臟切片 H&E 和 ORO 染色代表圖及 ORO 染色統(tǒng)計(jì)分析。（E–H）WT、WT+PE（30 mg/kg）、HNRNPA1KO 和 HNRNPA1KO+PE（30 mg/kg）各組血清 ALT（E）、AST（F）、TC（G）和 TG（H）水平。（I–L）WT、WT+PE（30 mg/kg）、HNRNPA1KO 和 HNRNPA1KO+PE（30 mg/kg）各組 ATP 檢測(cè)結(jié)果（I）以及 CPT2（J）、ACADM（K）和 ACADL（L）的 mRNA 水平。數(shù)據(jù)以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示（n = 6 或 3）。，p < 0.05；，p < 0.01；，p < 0.001；****，p < 0.0001；ns，p > 0.05。

圖 9. PE 通過(guò)靶向 HNRNPA1 并調(diào)控 PPARα 信號(hào)通路增強(qiáng)線粒體脂肪酸 β-氧化，從而緩解 MASLD。
PE 通過(guò)直接結(jié)合 HNRNPA1 穩(wěn)定 PPARα mRNA，并增強(qiáng)線粒體脂肪酸 β-氧化，從而緩解 MASLD。

【Citation】:Zhou, Y., Chi, J., Xu, X., Zhu, R., Wang, T., Zhang, T., Hong, D., Fu, H., Zhou, X., & Zhao, K. (2026). Pedunculoside ameliorates metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease by targeting HNRNPA1 and modulating PPARα signaling pathway to enhance Mitochondrial Fatty Acid β-Oxidation.Phytomedicine : international journal of phytotherapy and phytopharmacology, 153, 157910.

【貢獻(xiàn)】★★★★★

本研究證明，PE 可通過(guò)直接結(jié)合 HNRNPA1 穩(wěn)定 PPARα mRNA，并增強(qiáng)線粒體脂肪酸 β-氧化，從而緩解 MASLD。這些結(jié)果為 PE 在 MASLD 及相關(guān)代謝性疾病中的治療潛力提供了新的機(jī)制解釋。此外，將天然活性化合物作為分子探針，是發(fā)現(xiàn) MASLD 新型治療靶點(diǎn)的一種有前景策略；在這一框架下，HNRNPA1 可能成為一個(gè)潛在候選靶點(diǎn)。

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