Phytomedicine (IF=11.3，TOP)｜白芍總苷抑制頭頸鱗癌：靶向SLC7A5阻斷亮氨酸攝取，進而壓制mTOR信號通路！(李清林/賈興—浙江省立同德)

2026年7月11日，浙江中醫藥大學附屬浙江省立同德醫院李清林團隊、浙江省腫瘤醫院賈興團隊等，在Phytomedicine （中科院1區，TOP期刊，IF=11.3）在線發表題為“Total Glucosides of Paeony modulates leucine metabolism by inhibiting SLC7A5, antagonizing mTOR signaling to suppress head and neck squamous cell carcinoma”的研究論文。該文于2026年1月21日投稿，2026年7月6日修回，2026年7月9日接收。

頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）具有復發、轉移和治療耐受等臨床難題。該研究聚焦天然藥物活性提取物白芍總苷（TGP），系統評估其對HNSCC細胞增殖、遷移、上皮-間質轉化和凋亡的影響，并結合轉錄組測序、WGCNA、LASSO機器學習、單細胞RNA測序、分子對接、HPLC成分驗證、異種移植瘤和同系小鼠模型，解析其潛在抗腫瘤機制。

研究發現，TGP可下調氨基酸轉運蛋白SLC7A5，減少細胞內亮氨酸攝取，進一步降低亮氨酸代謝產物α-酮異己酸（KIC）水平，并抑制mTOR/ULK1/S6K信號通路，從而限制HNSCC細胞增殖和遷移。SLC7A5過表達或mTOR激活劑MHY1485可削弱TGP的抑制作用，而SLC7A5敲低則可模擬TGP的抗腫瘤表型。動物實驗還提示，TGP在抑制腫瘤生長的同時可改善免疫抑制性腫瘤微環境。需要注意的是，該研究主要基于細胞實驗和小鼠模型，不能直接等同于人體臨床療效。

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【摘 要】

背景：頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是全球重要健康挑戰之一，其特點包括患者生存率較低、轉移發生頻繁。傳統治療常受到全身毒性和耐藥性的限制，因此，白芍總苷（Total Glucosides of Paeony，TGP）等天然生物活性提取物被認為具有潛在治療價值。氨基酸轉運蛋白SLC7A5已被證明可通過促進亮氨酸攝取并激活mTOR信號通路來驅動腫瘤增殖，但TGP與HNSCC中SLC7A5/mTOR軸之間的具體關系尚未完全闡明。

目的：本研究旨在評價TGP對HNSCC的抑制作用，并探討其潛在分子機制。

方法：研究采用人源HNSCC細胞系CAL27、FADU和小鼠HNSCC細胞系SCC7，通過多維表型實驗評價TGP的抗腫瘤作用，其中包括Western blot檢測上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）標志物。研究進一步結合加權基因共表達網絡分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）、最小絕對收縮和選擇算子（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）以及單細胞RNA測序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）篩選核心靶點，并通過分子對接進行結構模擬，再利用患者組織芯片進行驗證。體內研究則在多個細胞來源異種移植瘤和同系小鼠模型中評價劑量-反應關系及救援實驗，并結合下游代謝檢測和免疫表型流式分析。

結果：TGP可劑量依賴性抑制HNSCC細胞增殖、遷移和EMT進程，同時誘導細胞凋亡。體內實驗中，TGP在三種細胞來源模型中均可限制腫瘤體積和重量，且未觀察到明顯系統性細胞毒性。轉錄組測序結合WGCNA和LASSO分析確定SLC7A5是TGP作用于HNSCC的重要靶點。機制上，TGP抑制SLC7A5及其下游亮氨酸代謝酶BCAT1、BCKDHA和BCKDHB的表達，從而降低代謝物α-酮異己酸（α-ketoisocaproate，KIC）水平，并關閉mTOR信號級聯。SLC7A5敲低可復制TGP產生的治療表型，而SLC7A5過表達或mTOR激動劑MHY1485可有效削弱這些效應。此外，TGP還可在體內重塑免疫抑制性腫瘤微環境。

結論：TGP通過靶向SLC7A5降低亮氨酸攝取，從而抑制mTOR信號軸活性，進而抑制HNSCC增殖。

01

研究背景及科學問題

頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）主要發生于頭頸部黏膜上皮組織，例如口腔、咽部和喉部，是全球常見惡性腫瘤之一。近年來，HNSCC治療策略已逐漸從傳統手術聯合放化療，轉向包含靶向治療、免疫檢查點抑制劑和細胞治療在內的綜合治療模式。然而，患者總體生存改善仍不理想。局部晚期HNSCC患者5年生存率仍約為50%，且超過半數患者在接受根治性同步放化療后出現局部復發或遠處轉移，給臨床治療帶來巨大挑戰。

當前HNSCC治療仍面臨多重限制。首先，放療和化療對正常組織的損傷限制了治療劑量強度，導致療效不足。其次，以PD-1抑制劑為代表的免疫檢查點阻斷療法雖然帶來一定希望，但在鉑耐藥復發/轉移性HNSCC中的應答率仍然較低。第三，即使將抗EGFR單克隆抗體等靶向治療納入標準治療方案，患者獲得的生存獲益仍有限，且最終不可避免出現耐藥。因此，探索替代或輔助治療策略具有重要意義。

天然植物來源生物活性成分因具有多靶點、多通路調控能力以及相對較好的安全性，正成為越來越受關注的研究方向。白芍總苷（TGP）是從芍藥Paeonia lactiflora Pall.干燥根中提取的活性成分復合物，主要由單萜苷類成分組成，包括芍藥苷、白芍內酯苷、氧化芍藥苷和苯甲酰芍藥苷等，其中芍藥苷約占60%—90%?，F代藥理學研究顯示，TGP具有多種生物活性，包括抑制自身免疫反應、調節免疫平衡和抑制腫瘤細胞增殖等。然而，TGP在HNSCC中的研究仍較少。作者認為，TGP在HNSCC治療中可能通過調節腫瘤微環境和抑制腫瘤增殖發揮抗腫瘤效應，但其具體機制仍需進一步明確。

溶質載體家族7成員5（solute carrier family 7 member 5，SLC7A5），又稱L型氨基酸轉運蛋白1（L-type amino acid transporter 1，LAT1），是一種定位于細胞膜的大型中性氨基酸轉運蛋白。SLC7A5是必需氨基酸進入細胞的重要通路，可介導亮氨酸、谷氨酰胺和芳香族氨基酸等物質跨膜轉運。在腫瘤微環境中，SLC7A5常出現異常高表達，并已在乳腺癌、肺癌、結直腸癌和膽囊癌等多種惡性腫瘤中被檢測到高水平表達。

既往研究表明，SLC7A5高表達可顯著增強腫瘤細胞攝取必需氨基酸的能力，為腫瘤快速生長和增殖提供營養基礎。腫瘤細胞高度依賴SLC7A5介導的氨基酸轉運，即使在營養受限的腫瘤微環境中，也能夠獲取必需氨基酸，維持惡性生長和增殖活性，從而獲得獨特的生存優勢。

亮氨酸是一種關鍵營養信號分子，可通過SLC7A5進入細胞。亮氨酸與感受蛋白Sestrin2結合后，可激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）信號通路。mTORC1是調控細胞合成代謝的重要通路，可通過兩條途徑促進蛋白質合成：一是通過磷酸化使真核翻譯起始因子4E結合蛋白1（4E-BP1）失活，二是通過磷酸化激活核糖體蛋白S6激酶1（S6K1）。mTORC1參與細胞信號轉導，調節營養合成、細胞增殖和血管生成，最終推動腫瘤細胞異常增殖。SLC7A5過表達的腫瘤細胞通常具有更強的亮氨酸攝取能力，過量亮氨酸進一步激活mTOR信號通路，加速細胞周期進展并促進腫瘤細胞惡性增殖。

本研究系統考察TGP對HNSCC的抑制作用及其潛在機制。研究結果提示，TGP可通過下調SLC7A5表達，降低細胞內亮氨酸水平，從而抑制mTOR信號通路并發揮抗HNSCC作用。

02

重要發現及亮點

TGP抑制HNSCC細胞增殖、遷移和EMT，并誘導凋亡

研究首先檢測TGP對HNSCC細胞的影響。結果顯示，TGP在不同HNSCC細胞系中的半數抑制濃度（IC??）分別為：CAL27細胞1659 μg/mL、FADU細胞1145 μg/mL、SCC7細胞802.9 μg/mL。基于這些結果，研究設置不同的低劑量和高劑量TGP處理濃度用于后續實驗。

CCK-8實驗顯示，TGP可劑量依賴性抑制HNSCC細胞增殖。EdU染色進一步表明，隨著TGP濃度升高，代表增殖細胞的綠色熒光信號逐漸減弱。克隆形成實驗也顯示，TGP顯著降低HNSCC細胞形成克隆的能力，說明其可有效抑制細胞增殖。

隨后，研究采用Transwell遷移實驗和劃痕實驗評估TGP對HNSCC細胞遷移能力的影響。結果顯示，TGP處理48小時后，遷移細胞數量顯著減少，并呈濃度依賴趨勢。劃痕實驗也支持這一結果。在分子水平上，TGP降低間質標志物N-cadherin和Vimentin的蛋白表達，提示TGP可抑制EMT過程。此外，Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術顯示，TGP處理可誘導明顯細胞凋亡。為排除非特異性培養環境因素干擾，研究還檢測了含不同濃度TGP培養基的pH值和滲透壓，發現TGP未顯著改變培養基pH和滲透壓。

圖1：TGP抑制HNSCC細胞增殖、遷移，并誘導細胞凋亡。（A）CAL27、FADU和SCC7細胞經溶劑對照（Control）、低劑量TGP（TGP-low）和高劑量TGP（TGP-high）處理后，通過CCK-8實驗檢測細胞增殖曲線。（B）EdU摻入實驗代表性圖像，顯示不同處理條件下的增殖細胞；綠色表示EdU，藍色表示Hoechst。（C）克隆形成實驗顯示HNSCC細胞的克隆存活能力。（D）Transwell遷移實驗顯示TGP處理后細胞遷移減少。（E）Western blot分析EMT標志物N-Cadherin和Vimentin，β-ACTIN作為上樣內參。（F）HNSCC細胞經Annexin V-FITC/PI染色后進行流式細胞術凋亡分析，并對凋亡率進行定量。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

SLC7A5被確定為TGP抑制HNSCC的重要靶點

為探索TGP抑制HNSCC的潛在機制，研究對TGP或PBS處理48小時后的HNSCC細胞進行轉錄組測序。通過DESeq2標準化差異表達分析，比較不同處理組之間的基因表達變化。研究將高劑量TGP相對對照組下調基因、低劑量TGP相對對照組下調基因，以及高劑量TGP相對低劑量TGP進一步下調基因取交集，最終獲得77個TGP相關基因。

為識別與HNSCC直接相關的基因，研究下載TCGA-HNSC轉錄組數據，其中包括520個腫瘤樣本和44個正常樣本，并采用WGCNA構建基因共表達網絡。分析顯示，綠色模塊包含609個基因，與腫瘤表型具有最高絕對相關系數，因此被定義為HNSCC腫瘤相關關鍵模塊。KEGG富集分析顯示，該模塊基因與代謝通路、PI3K-AKT通路、MAPK信號通路和mTOR通路相關。

隨后，研究對綠色模塊中的基因進行LASSO機器學習回歸篩選，最終識別出33個候選基因。進一步通過Cox回歸分析建立由10個基因構成的預后特征，包括PTK7、GNA12、VDR、SLC7A5、EXTL3、COL4A5、KLF7、FADS3、RRAGD和SEMA4D。該風險模型可區分高風險和低風險患者，高風險組死亡率更高、生存時間更短。模型在1年、3年、5年和10年總體生存預測中的AUC分別為0.64、0.69、0.59和0.73。

最后，將LASSO篩選基因與TGP相關基因交叉分析，獲得兩個關鍵基因：SLC7A5和SLC3A2。SLC7A5是重要氨基酸轉運蛋白，可與SLC3A2通過二硫鍵形成異二聚體，維持其細胞膜定位并執行氨基酸轉運功能。在TCGA-HNSC數據庫中，SLC7A5在腫瘤組織中高表達。生存分析顯示，SLC7A5高表達患者生存時間顯著短于低表達患者。GSE37991、GSE30784、GSE23558和GSE107591四個外部數據集也一致驗證了SLC7A5在HNSCC腫瘤組織中較正常組織顯著升高。

組織芯片免疫組化進一步證實，SLC7A5蛋白在HNSCC腫瘤組織中較配對癌旁正常組織明顯上調。根據KI-67和SLC7A5染色強度對HNSCC標本進行分層后，研究觀察到二者表達存在一致趨勢：SLC7A5低表達組織中KI-67陽性較少，而SLC7A5高表達組織中KI-67陽性增殖細胞明顯增多。這提示SLC7A5高表達與HNSCC腫瘤細胞高增殖狀態密切相關。

圖2：SLC7A5是TGP抑制HNSCC的重要靶點。（A）實驗流程圖。（B）差異表達基因火山圖。（C）77個TGP相關基因的篩選過程。（D）WGCNA分析。（E）KEGG分析。（F）LASSO回歸分析。（G）LASSO篩選基因與TGP相關基因集（TRGS）的交叉分析。（H）TCGA-HNSC數據庫中SLC7A5表達分析。（I）TCGA-HNSC數據庫中SLC7A5的生存分析。（J）GSE37991、GSE30784、GSE23558和GSE107591數據庫中SLC7A5表達分析。

單細胞轉錄組揭示HNSCC中SLC7A5的細胞類型特異性上調

雖然bulk轉錄組已證實SLC7A5在HNSCC中的總體上調及預后意義，但整體測序平均效應可能掩蓋腫瘤內部異質性和不同細胞類型中的分布差異。為在單細胞水平解析SLC7A5表達結構，研究分析了GSE181919單細胞RNA測序數據集，該數據集包含HNSCC病灶及正常對照組織中大量單細胞轉錄組信息。

無監督聚類和UMAP可視化將腫瘤微環境中的細胞分為12類細胞譜系，包括B細胞、漿細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、增殖性T細胞、上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞、脂質相關巨噬細胞和肥大細胞。各細胞類型身份通過經典譜系標志物表達得到驗證。與正常組織相比，腫瘤組織中的細胞組成發生明顯重塑，其中上皮細胞等細胞群比例發生變化。

SLC7A5表達具有明顯異質性。整體來看，SLC7A5在多種基質細胞中基線表達較低，但在T細胞亞群中相對富集，尤其是在CD4+和CD8+ T細胞中更明顯。進一步比較正常與癌組織顯示，SLC7A5在惡性來源上皮細胞和腫瘤浸潤CD8+ T細胞中選擇性且顯著上調。

研究還將癌組織中的惡性上皮細胞分為SLC7A5高表達和低表達亞群進行富集分析。結果顯示，SLC7A5高表達亞群富集G2M檢查點、EMT、血管生成、缺氧和膽固醇穩態等高增殖和侵襲性腫瘤特征，同時伴隨部分代謝處理通路抑制。KEGG分析進一步顯示，上調基因富集于細胞周期、黏著斑和癌癥蛋白聚糖等通路。GO細胞組分分析顯示，SLC7A5高表達與細胞-基質連接、黏著斑、紡錘體和染色體區域等結構相關過程增強有關，提示其與腫瘤細胞有絲分裂和結構重塑密切相關。

圖3：單細胞RNA測序分析揭示人HNSCC組織中SLC7A5表達具有細胞類型特異性。（A）UMAP圖顯示數據集中所有細胞的細胞類型注釋。（B）熱圖顯示已鑒定細胞類型中標志基因表達情況。（C）UMAP圖比較正常組織（NL）和癌組織（CA）之間的細胞類型分布。（D）柱狀圖顯示NL組和CA組中各細胞類型的相對比例。（E）UMAP圖顯示SLC7A5表達細胞的分布。（F）小提琴圖顯示不同細胞類型中SLC7A5表達水平。（G）UMAP圖顯示NL和CA組織中SLC7A5表達情況。（H）小提琴圖比較NL組和CA組中上皮細胞（左）及CD8+ T細胞（右）的SLC7A5表達。

TGP在體內外下調SLC7A5并抑制亮氨酸代謝

Western blot和qRT-PCR結果顯示，TGP可劑量依賴性降低CAL27、FADU和SCC7細胞中SLC7A5蛋白和mRNA表達。鑒于SLC7A5是大型中性氨基酸，尤其是亮氨酸攝取的主要功能轉運蛋白，研究進一步檢測細胞內亮氨酸含量。結果顯示，TGP顯著耗竭細胞內亮氨酸池，說明TGP介導的SLC7A5抑制確實會削弱HNSCC細胞營養攝取。

為了判斷SLC7A5抑制導致的亮氨酸攝取下降是否會影響下游代謝處理，研究檢測支鏈氨基酸（branched-chain amino acid，BCAA）分解代謝級聯關鍵組分。TGP顯著降低支鏈氨基酸轉氨酶1（BCAT1）以及支鏈α-酮酸脫氫酶復合物核心亞基BCKDHA和BCKDHB的蛋白表達。與此一致，亮氨酸經BCAT1轉氨生成的直接下游代謝物KIC在TGP處理后呈劑量依賴性降低。

體內實驗方面，研究建立CAL27和FADU來源異種移植瘤模型。腫瘤照片、生長曲線和腫瘤重量均顯示，TGP可在兩種模型中劑量依賴性抑制腫瘤生長。Ki-67和SLC7A5免疫組化進一步證實，TGP可抑制腫瘤組織增殖并降低SLC7A5表達。腫瘤組織Western blot也驗證了TGP對SLC7A5蛋白表達的抑制作用。腫瘤組織亮氨酸水平熱圖顯示，TGP在體內同樣明顯降低亮氨酸積累。

研究還采用人SLC7A5高分辨率冷凍電鏡結構（PDB: 8XPU）進行虛擬篩選和分子對接，以闡明TGP活性成分與SLC7A5之間的直接結合關系。基于既往質譜和SwissADME分析確定的21種TGP藥物樣成分，結果顯示三種主要單萜苷類成分——苯甲酰芍藥苷、芍藥苷和白芍內酯苷——與SLC7A5表現出較強結合潛力，結合能分別為?12.234 kcal/mol、?11.036 kcal/mol和?10.832 kcal/mol。三維對接模型和二維相互作用圖顯示，這些成分可穩定結合SLC7A5功能性底物結合口袋，并與PHE-252、ALA-253、TYR-254、ASN-404、ILE-63、GLY-65和SER-66等關鍵氨基酸殘基形成氫鍵和疏水作用。

為驗證計算預測并確認TGP化學組成，研究進一步開展HPLC分析。TGP在230 nm下呈現多峰特征色譜圖。通過與標準品保留時間比較，研究確認TGP樣品中存在分子對接排名靠前的三種成分：芍藥苷、苯甲酰芍藥苷和白芍內酯苷。這不僅驗證了TGP樣品的化學組成和質量，也從實驗層面證實預測的活性成分確實存在于該草藥混合物中。

在免疫完整環境中，研究進一步建立SCC7同系皮下腫瘤模型。與CAL27和FADU異種移植瘤結果一致，TGP顯著降低腫瘤體積和重量。流式細胞術顯示，TGP顯著降低區域淋巴結和原發腫瘤組織中SLC7A5平均熒光強度。腫瘤微環境免疫表型分析顯示，TGP可將免疫抑制性生態位重塑為更活躍的抗腫瘤表型，表現為功能性CD4+和CD8+ T細胞、M1巨噬細胞（CD11b+F4/80+CD86+）浸潤增加，同時促腫瘤Treg細胞（CD4+CD25+FOXP3+）和M2巨噬細胞（CD11b+F4/80+CD206+）減少。腹股溝淋巴結中效應CD4+和CD8+ T細胞也擴增，而Treg比例下降。主要器官H&E染色未觀察到明顯組織學損傷，支持TGP在該實驗條件下具有較好的體內安全性。

圖4：TGP在HNSCC異種移植瘤模型中抑制腫瘤生長、下調SLC7A5表達并降低亮氨酸水平。（A）CAL27、FADU和SCC7細胞經溶劑對照（Control）、低劑量TGP（TGP-low）或高劑量TGP（TGP-high）處理后，SLC7A5蛋白表達的Western blot分析，β-ACTIN作為上樣內參。（B—C）在相同處理條件下，三種細胞系中SLC7A5 mRNA表達的qRT-PCR定量分析。（D）TGP處理后，CAL27、FADU和SCC7細胞培養上清中亮氨酸濃度。（E、H）CAL27（E）和FADU（H）異種移植瘤小鼠經溶劑、TGP 20 mg/kg或TGP 40 mg/kg處理后，剝離腫瘤的代表性圖像。（F、I）CAL27（F）和FADU（I）異種移植瘤模型中，腫瘤體積隨時間變化的生長曲線。（G、J）CAL27（G）和FADU（J）異種移植瘤實驗終點測得的腫瘤重量。（K、L）CAL27（K）和FADU（L）腫瘤組織中Ki-67（增殖標志物）和SLC7A5免疫組織化學染色。（M）CAL27和FADU異種移植瘤組織中SLC7A5蛋白表達的Western blot分析。（N）熱圖顯示CAL27、FADU和SCC7異種移植瘤組織在不同處理條件下的亮氨酸濃度。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

圖5：白芍總苷（TGP）及其標準品的HPLC化學譜圖。（A）TGP在230 nm下的HPLC色譜圖，顯示該草藥混合物的特征化學譜圖。圖中標注了對應三種已鑒定植物化學成分的峰。（B—D）標準品HPLC色譜圖：（B）芍藥苷（保留時間RT=7.74 min）；（C）苯甲酰芍藥苷（RT=11.77 min）；（D）白芍內酯苷（RT=7.55 min）。TGP混合物與標準品之間的保留時間匹配確認了這些植物化學成分的身份。色譜條件：C18柱，20 min內5%—98% B梯度洗脫，230 nm檢測，進樣體積10 μL。

SLC7A5過表達可逆轉TGP對HNSCC的抑制作用

為驗證TGP是否通過下調SLC7A5抑制HNSCC，研究開展SLC7A5過表達補償實驗。細胞分為四組：G1為Control組，轉染1 μg/mL對照質粒；G2為TGP組，轉染對照質粒后接受TGP處理48小時；G3為OE-SLC7A5組，轉染1 μg/mL SLC7A5過表達質粒；G4為OE-SLC7A5+TGP組，轉染SLC7A5過表達質粒后再接受TGP處理48小時。

mRNA和蛋白結果顯示，G3組較G1組顯著上調SLC7A5表達；G4組較G2組也顯著提高SLC7A5表達，提示SLC7A5表達獲得部分恢復。功能實驗顯示，G3組較G1組顯著增強HNSCC細胞增殖、克隆形成和遷移能力；而G4組較G2組也明顯恢復這些生物學特性。SLC7A5過表達還顯著增加細胞內亮氨酸含量，G4組較TGP單獨處理組亮氨酸水平明顯回升。

由于細胞內亮氨酸是激活mTOR信號軸的重要上游觸發因素，研究進一步檢測mTOR/ULK1通路。結果顯示，TGP誘導的mTOR/ULK1通路抑制在SLC7A5過表達后明顯被重新激活，表現為p-mTOR、p-ULK1和p-S6K磷酸化水平恢復。TGP對EMT過程的阻斷也在SLC7A5上調后被逆轉。上述結果表明，SLC7A5異位過表達可抵消TGP對HNSCC細胞的內在抑制效應。

體內驗證方面，TGP在CAL27、FADU和SCC7模型中均可劑量依賴性抑制腫瘤組織中mTOR、ULK1和S6K磷酸化。隨后，研究在FADU異種移植瘤模型中進行體內救援實驗。腫瘤形態、腫瘤體積曲線和終點腫瘤重量均顯示，SLC7A5過表達顯著削弱TGP的治療效應，使腫瘤生長明顯恢復。免疫組化顯示，與TGP單獨處理相比，OE+TGP組SLC7A5免疫反應和Ki-67增殖指數均明顯恢復。腫瘤組織Western blot也證實，SLC7A5過表達可恢復被TGP壓低的p-mTOR、p-ULK1和p-S6K水平。這些結果說明，TGP在體內的抗腫瘤活性依賴其對SLC7A5/mTOR信號軸的干擾。

圖6：SLC7A5過表達逆轉TGP對HNSCC的抑制作用。（A）四個實驗組示意圖：G1，Control；G2，TGP處理；G3，SLC7A5過表達（OE-SLC7A5）；G4，SLC7A5過表達聯合TGP處理（OE-SLC7A5+TGP）。（B）CAL27、FADU和SCC7細胞中SLC7A5蛋白表達的代表性Western blot圖像（左）及相應定量分析（右）。GAPDH作為上樣內參。（C）CCK-8實驗檢測四種處理條件下HNSCC細胞增殖曲線。（D）克隆形成實驗顯示HNSCC細胞克隆存活能力。（E）Transwell遷移實驗顯示HNSCC細胞遷移能力。（F）不同處理條件下CAL27、FADU和SCC7細胞培養上清中的亮氨酸濃度。（G）mTOR/ULK1通路關鍵蛋白p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1、p-S6K和S6K的代表性Western blot圖像，GAPDH作為上樣內參。（H）熱圖顯示mTOR/ULK1通路中磷酸化蛋白/總蛋白比值的定量分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

圖7：SLC7A5過表達在HNSCC異種移植瘤模型中挽救TGP的抗腫瘤效應。（A）CAL27、FADU和SCC7細胞經溶劑對照（Control）、TGP 20 mg/kg或TGP 40 mg/kg處理后，mTOR通路相關蛋白p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1、p-S6K和S6K的代表性Western blot圖像。GAPDH作為上樣內參。（B）四組小鼠剝離腫瘤的代表性圖像：Control、TGP、OE-SLC7A5和OE-SLC7A5+TGP（OE+TGP）。（C）四個處理組中腫瘤體積隨時間變化的生長曲線。（D）實驗終點測得的腫瘤重量。（E）四組腫瘤組織中SLC7A5和Ki-67免疫組織化學染色。（F）四組腫瘤組織中mTOR通路相關蛋白的Western blot分析。GAPDH作為上樣內參。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

SLC7A5敲低可模擬TGP的抗腫瘤效應

為進一步確認TGP通過下調SLC7A5發揮抑制作用，研究使用小干擾RNA（siRNA）敲低SLC7A5，觀察該操作是否能模擬TGP的抗腫瘤效應。細胞分為三組：G1組轉染50 nM陰性對照siRNA；G2組轉染50 nM陰性對照siRNA后接受TGP處理48小時；G3組轉染50 nM SLC7A5-siRNA。

與G1組相比，G2和G3組SLC7A5表達均顯著下調。SLC7A5沉默顯著抑制細胞增殖、克隆形成和遷移，其表型變化與TGP處理高度一致。SLC7A5敲低還導致細胞內亮氨酸含量顯著下降。Western blot顯示，SLC7A5敲低顯著抑制mTOR、ULK1和S6K磷酸化，從而使mTOR/ULK1信號通路失活，這與TGP產生的抑制作用高度一致。此外，SLC7A5敲低也降低EMT標志物蛋白水平，其抑制作用與TGP處理相當。進一步研究顯示，SLC7A5過表達會降低HNSCC細胞對TGP的敏感性，而SLC7A5敲低會增強TGP敏感性，提示SLC7A5是決定TGP反應的重要因素。

圖8：SLC7A5敲低模擬TGP的抗腫瘤效應，并抑制HNSCC細胞中的mTOR通路。（A）三個實驗組示意圖：G1，Control；G2，TGP處理；G3，SLC7A5敲低（si-SLC7A5）。（B）CAL27、FADU和SCC7細胞中SLC7A5蛋白表達的代表性Western blot圖像（左）及相應定量分析（右）。β-ACTIN作為上樣內參。（C）CCK-8實驗檢測三種處理條件下HNSCC細胞增殖曲線。（D）克隆形成實驗顯示HNSCC細胞克隆存活能力。（E）Transwell遷移實驗顯示HNSCC細胞遷移能力。（F）不同處理條件下CAL27、FADU和SCC7細胞培養上清中的亮氨酸濃度。（G）mTOR/ULK1通路關鍵蛋白p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1、p-S6K和S6K的代表性Western blot圖像，GAPDH作為上樣內參。（H）熱圖顯示mTOR/ULK1通路中磷酸化蛋白/總蛋白比值的定量分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

TGP抑制HNSCC依賴mTOR信號軸調控

考慮到mTOR通路在細胞穩態和生長調節中的關鍵作用，研究推測TGP介導的HNSCC抑制依賴該信號軸。為驗證因果關系，研究使用特異性mTOR激動劑MHY1485進行藥理學擾動實驗。

結果顯示，MHY1485重新激活mTOR通路后，可顯著削弱TGP對細胞增殖、克隆形成和遷移能力的抑制。Western blot也證實，MHY1485可恢復被TGP抑制的p-mTOR、p-ULK1和p-S6K磷酸化水平。相反，使用特異性mTOR抑制劑雷帕霉素可復制TGP產生的腫瘤抑制效應，進一步支持mTOR軸在HNSCC進展中具有重要作用。

圖9：MHY1485激活mTOR信號可逆轉TGP在HNSCC細胞中的抗增殖和抗克隆形成作用。（A）CAL27、FADU和SCC7細胞經溶劑對照（Control）、TGP單獨處理或TGP聯合mTOR激活劑MHY1485處理后，通過CCK-8實驗檢測細胞增殖曲線。（B）克隆形成實驗顯示相同處理條件下細胞克隆存活能力。（C）Transwell遷移實驗顯示細胞遷移能力。（D）mTOR通路相關蛋白p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1、p-S6K和S6K的代表性Western blot分析。GAPDH作為上樣內參。（E）熱圖顯示mTOR通路中磷酸化蛋白/總蛋白比值的定量分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

TGP通過SLC7A5選擇性限制亮氨酸供應，而非造成非特異性氨基酸剝奪

為系統界定TGP抑制作用的底物特異性，研究分別補充SLC7A5主要轉運底物亮氨酸，以及非目標大型氨基酸精氨酸，進行雙向營養救援實驗。48小時和96小時CCK-8細胞活性實驗顯示，單獨補充亮氨酸或精氨酸均可促進基礎生長；但在TGP壓力下，二者表現出明顯不同的結果。外源亮氨酸可部分緩沖和補償TGP的細胞毒性，使細胞活力維持在較高水平；相反，精氨酸無法減輕TGP毒性，Arginine+TGP組仍表現出明顯細胞死亡。

Transwell遷移實驗進一步證實這種底物選擇性：外源亮氨酸可部分恢復TGP介導的遷移抑制，而精氨酸完全不能挽救TGP的抗遷移作用。分子水平上，亮氨酸補充在TGP作用下仍可部分維持p-mTOR、p-ULK1和p-S6K磷酸化水平，提示其可能通過與SLC7A5轉運過程相關的競爭性底物補償機制發揮作用。相反，TGP可完全壓制精氨酸驅動的通路激活，未見代謝補償跡象。

綜合來看，TGP并非通過非特異性氨基酸剝奪抑制HNSCC，而是通過阻斷SLC7A5介導的亮氨酸輸入，選擇性削弱腫瘤細胞營養供應和mTOR通路激活。

圖10：TGP通過抑制SLC7A5降低細胞內亮氨酸可利用性，引發支鏈氨基酸分解代謝酶代償性下調，并抑制HNSCC細胞中的mTOR信號。（A）Western blot分析CAL27、FADU和SCC7細胞經不同濃度TGP（低劑量/高劑量）處理后，支鏈氨基酸分解代謝關鍵酶BCAT1、BCKDHA和BCKDHB的表達，β-ACTIN作為上樣內參。（B）TGP處理后，細胞內α-酮異己酸（KIC）水平定量；KIC是亮氨酸分解代謝的關鍵代謝物。（C、D）HNSCC細胞經溶劑、亮氨酸單獨處理、亮氨酸聯合TGP處理、精氨酸單獨處理或精氨酸聯合TGP處理后，在48小時（C）和96小時（D）檢測細胞活力。（E）Transwell遷移實驗顯示相同處理條件下細胞遷移能力。（F）Western blot分析細胞經溶劑、TGP單獨處理、亮氨酸聯合TGP處理或精氨酸聯合TGP處理后，mTOR通路相關蛋白p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1、p-S6K和S6K的表達。β-ACTIN作為上樣內參。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

【貢獻】★★★★★

本研究證實，TGP可通過靶向SLC7A5-亮氨酸-mTOR信號軸抑制HNSCC。具體而言，TGP下調SLC7A5表達，減少亮氨酸攝取，降低亮氨酸下游代謝物KIC水平，并抑制mTOR、ULK1和S6K磷酸化，從而限制HNSCC細胞增殖、克隆形成、遷移和EMT進程，并促進細胞凋亡。

體內實驗顯示，TGP可抑制CAL27、FADU和SCC7模型中的腫瘤生長，并降低腫瘤組織SLC7A5表達和亮氨酸積累，同時在免疫完整小鼠模型中改善免疫抑制性腫瘤微環境。SLC7A5過表達和mTOR激活可削弱TGP的抗腫瘤效應，而SLC7A5敲低和mTOR抑制可模擬TGP作用，進一步支持SLC7A5-亮氨酸-mTOR軸是TGP發揮作用的關鍵通路。

該研究不僅拓展了天然產物調控腫瘤代謝重編程的機制認識，也為將TGP開發為HNSCC潛在低毒治療候選藥物提供了臨床前證據。不過，研究仍存在局限：尚未使用患者來源異種移植瘤（PDX）模型驗證個體化腫瘤異質性；TGP下調SLC7A5的上游分子機制仍未闡明；未來還需進一步評估TGP與HNSCC標準治療方案聯用時是否具有協同潛力。

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