增強(qiáng)子與啟動(dòng)子的分子機(jī)制及其在腫瘤中的作用

四個(gè)未解之謎

請(qǐng)記住四個(gè)問(wèn)題。本文后續(xù)的所有機(jī)制、技術(shù)、腫瘤案例,本質(zhì)上都是科學(xué)界嘗試回答它們的過(guò)程。帶著這些問(wèn)題閱讀,會(huì)發(fā)現(xiàn)每一個(gè)看似零碎的分子事件,其實(shí)都在向某個(gè)謎題靠近。

特異性之謎。 人類(lèi)基因組里大約有 100 萬(wàn)個(gè)增強(qiáng)子,而功能性的啟動(dòng)子只有約 2 萬(wàn)個(gè)。一個(gè)增強(qiáng)子憑什么知道要去激活某個(gè)特定啟動(dòng)子,而不是路過(guò)的其他啟動(dòng)子?它怎樣在密集的基因座里找到對(duì)的對(duì)象?

距離之謎。 增強(qiáng)子和它調(diào)控的啟動(dòng)子,在線(xiàn)性 DNA 上常常相隔幾十 kb 到幾個(gè) Mb。這種距離意味著兩段 DNA 真正接觸的概率非常低、時(shí)間也很短。可基因表達(dá)卻能穩(wěn)定輸出。增強(qiáng)子到底是必須親自跑去接觸啟動(dòng)子,還是可以遠(yuǎn)程指揮?

強(qiáng)度之謎。 同樣是增強(qiáng)子,為什么少數(shù)被稱(chēng)為超級(jí)增強(qiáng)子的家伙能驅(qū)動(dòng)定義細(xì)胞身份的關(guān)鍵基因(如干細(xì)胞的 OCT4、神經(jīng)母細(xì)胞瘤的 MYCN),而其他普通增強(qiáng)子只能維持基礎(chǔ)表達(dá)?這種從量變到質(zhì)變的閾值效應(yīng),機(jī)制上是什么?

致癌之謎。 過(guò)去三十年的腫瘤研究主要聚焦在編碼區(qū)突變(比如 TP53、KRAS)。但越來(lái)越多的證據(jù)表明,大量驅(qū)動(dòng)突變其實(shí)發(fā)生在增強(qiáng)子和啟動(dòng)子等非編碼調(diào)控元件上,有些癌癥甚至完全沒(méi)有典型的驅(qū)動(dòng)突變,卻被異常的轉(zhuǎn)錄程序綁架。為什么癌細(xì)胞會(huì)對(duì) BRD4、CDK7 這類(lèi)看似全局性的通用因子表現(xiàn)出高度依賴(lài),一抑制就死?

下面開(kāi)始鋪墊機(jī)制,每一節(jié)都在悄悄回答這些謎題的某一面。

一、增強(qiáng)子的分子機(jī)制 1. 定義、典型增強(qiáng)子與超級(jí)增強(qiáng)子

增強(qiáng)子本身就是一段 DNA 序列(不是蛋白質(zhì),也不是 RNA),位于基因組非編碼區(qū),能在遠(yuǎn)距離上調(diào)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,通常具有方向無(wú)關(guān)性。

打個(gè)比方,如果把基因組想象成一座城市,啟動(dòng)子就像每棟大樓門(mén)口的開(kāi)關(guān),決定樓里的燈(基因)亮不亮;增強(qiáng)子則像市里某處的調(diào)光控制器,可以遠(yuǎn)程撥動(dòng)這個(gè)開(kāi)關(guān)、調(diào)節(jié)亮度。控制器和大樓之間不需要相鄰,可以隔著幾條街甚至更遠(yuǎn),只要城市的道路系統(tǒng)(也就是染色質(zhì)的三維折疊)把它們帶到一起就能起作用。控制器倒過(guò)來(lái)裝也能用,這就是方向無(wú)關(guān)性的直觀(guān)含義。

典型增強(qiáng)子(typical enhancer)長(zhǎng)度約 200 到 2000 bp。bp 是堿基對(duì)(base pair),DNA 的最小長(zhǎng)度單位,1 bp 即一對(duì)堿基。作為參照,人類(lèi)基因組全長(zhǎng)約 30 億 bp,一個(gè)典型基因平均長(zhǎng)度數(shù)萬(wàn) bp,所以一個(gè)增強(qiáng)子相當(dāng)于一個(gè)基因的幾十分之一到幾百分之一長(zhǎng)。在染色質(zhì)上它攜帶兩個(gè)標(biāo)志性的化學(xué)修飾:H3K4me1 和 H3K27ac,具體含義稍后解釋。

超級(jí)增強(qiáng)子(super-enhancer, SE)是 Whitehead 研究所 Richard Young 實(shí)驗(yàn)室在 2013 年提出的新概念。它本質(zhì)上不是單個(gè)增強(qiáng)子,而是一連串密集排列、被極強(qiáng)信號(hào)修飾的增強(qiáng)子簇。研究者用一種叫 ROSE(Rank Ordering of Super-Enhancers)的算法,把所有增強(qiáng)子按 H3K27ac 或 BRD4 等關(guān)鍵蛋白的結(jié)合強(qiáng)度排序,會(huì)發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)增強(qiáng)子信號(hào)平平,只有少數(shù)幾百個(gè)增強(qiáng)子的信號(hào)陡峭飆升,這些信號(hào)金字塔頂端的就是 SE。SE 通常長(zhǎng)度超過(guò) 8 到 20 kb(1 kb = 1000 bp),是普通增強(qiáng)子的 10 到 20 倍,蛋白結(jié)合密度也高出數(shù)量級(jí)。

更關(guān)鍵的是,SE 優(yōu)先驅(qū)動(dòng)定義細(xì)胞身份的關(guān)鍵基因:胚胎干細(xì)胞中的 OCT4、SOX2、NANOG;T 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)中的 RUNX1、TAL1;神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的 MYCN、PHOX2B、GATA3、HAND2。這種少數(shù) SE 驅(qū)動(dòng)決定命運(yùn)的少數(shù)基因的格局,是細(xì)胞身份穩(wěn)定性的基礎(chǔ),也是腫瘤研究里反復(fù)出現(xiàn)的關(guān)鍵線(xiàn)索,對(duì)應(yīng)開(kāi)篇的強(qiáng)度之謎與致癌之謎。

2. 染色質(zhì)特征:活性增強(qiáng)子長(zhǎng)什么樣

要理解增強(qiáng)子如何工作,先要解釋組蛋白修飾這個(gè)概念。DNA 在細(xì)胞核里并不是裸露的,它纏繞在一種叫核小體的蛋白顆粒上,核小體的核心是 8 個(gè)組蛋白(histone)分子。組蛋白的尾巴會(huì)被各種酶貼上化學(xué)標(biāo)簽(甲基、乙酰基等),不同的標(biāo)簽組合就像路標(biāo),告訴細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄機(jī)器:這段 DNA 是開(kāi)放的還是關(guān)閉的、是激活的還是沉默的。這套標(biāo)簽系統(tǒng)就是組蛋白修飾。

命名法很簡(jiǎn)單。例如 H3K4me1,H3 表示組蛋白 H3,K4 表示這個(gè)蛋白的第 4 位賴(lài)氨酸,me1 表示在這個(gè)位置加了一個(gè)甲基。H3K27ac 就是 H3 的第 27 位賴(lài)氨酸上有一個(gè)乙酰基。

活性增強(qiáng)子的標(biāo)志性指紋是 H3K4me1 與 H3K27ac 同時(shí)存在。

H3K4me1(組蛋白 H3 第 4 位賴(lài)氨酸單甲基化)由 MLL3(KMT2C)和 MLL4(KMT2D)這兩個(gè)酶催化沉積,標(biāo)記著這附近的 DNA 是一個(gè)增強(qiáng)子。僅有這個(gè)標(biāo)記還不足以證明它正在工作,可能只是處于待命狀態(tài)。

H3K27ac(H3 第 27 位賴(lài)氨酸乙酰化)由 CBP/p300 這兩個(gè)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶催化,這是增強(qiáng)子真正開(kāi)機(jī)的標(biāo)志。乙酰基中和了賴(lài)氨酸的正電荷,削弱了組蛋白與負(fù)電的 DNA 之間的吸引力,染色質(zhì)變得松散,轉(zhuǎn)錄機(jī)器更容易接近。

活性增強(qiáng)子在結(jié)構(gòu)上還有幾個(gè)特點(diǎn)。中央有一段核小體缺失區(qū)(nucleosome-depleted region, NDR),好像把核小體擠開(kāi)了一塊空地,留給轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合;兩側(cè)的核小體上則成對(duì)放置著 H3K4me1 標(biāo)記;DNA 甲基化水平很低,被 TET 蛋白主動(dòng)脫甲基;并且常富含 H2A.Z 和 H3.3 這兩種組蛋白變體,它們使核小體更不穩(wěn)定、更易被推開(kāi)。

還有一類(lèi)有趣的半激活增強(qiáng)子叫預(yù)備態(tài)增強(qiáng)子(poised enhancer),同時(shí)攜帶 H3K4me1(激活標(biāo)簽)和 H3K27me3(抑制標(biāo)簽,由 PRC2 復(fù)合物中的 EZH2 催化)。這種踩著剎車(chē)的油門(mén)狀態(tài),在干細(xì)胞和分化早期細(xì)胞中常見(jiàn),意味著這個(gè)增強(qiáng)子已經(jīng)被標(biāo)記出來(lái)但還未啟動(dòng),只待一個(gè)合適的信號(hào)就能被切換為激活或永久沉默。

最后值得一提的是一個(gè)最近被顛覆的認(rèn)識(shí):MLL3/MLL4 的酶活與其支架功能可以解耦。這兩個(gè)酶雖然負(fù)責(zé)沉積 H3K4me1 標(biāo)記,但對(duì)增強(qiáng)子的真正貢獻(xiàn),可能更多來(lái)自它們作為分子腳手架的角色,招募 p300、招募 RNA Pol II,而不是 H3K4me1 標(biāo)記本身(Dorighi 等,Mol Cell 2017;Local-Chen 等 2023)。這提醒我們:修飾標(biāo)簽往往是結(jié)果而非原因,這是表觀(guān)遺傳學(xué)一個(gè)反復(fù)出現(xiàn)的教訓(xùn)。

3. eRNA

人們?cè)?jīng)以為增強(qiáng)子只是一段沉默的 DNA,被動(dòng)地被結(jié)合、被激活。直到 GRO-seq 等技術(shù)出現(xiàn),研究者發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)子本身也在被轉(zhuǎn)錄。

增強(qiáng)子產(chǎn)生的 RNA 被稱(chēng)為增強(qiáng)子 RNA(enhancer RNA, eRNA),由 RNA Pol II 在增強(qiáng)子區(qū)域雙向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生,通常缺乏 5′ 帽完整性、沒(méi)有 poly(A) 尾、半衰期只有幾分鐘,產(chǎn)生后很快被核外泌體降解。乍一看像是轉(zhuǎn)錄噪音,但研究逐漸揭示 eRNA 遠(yuǎn)不只是副產(chǎn)物,而是承擔(dān)著多個(gè)具體功能。

第一,穩(wěn)定增強(qiáng)子與啟動(dòng)子之間的染色質(zhì)環(huán)。eRNA 可以直接結(jié)合 cohesin 和 Mediator 這兩個(gè)蛋白復(fù)合物,它們都是把增強(qiáng)子和啟動(dòng)子拉到一起的關(guān)鍵繩索。eRNA 像粘合劑一樣讓這個(gè)三維結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。

第二,釋放暫停的 RNA Pol II。在很多基因的啟動(dòng)子下游 30 到 60 nt(nt 即核苷酸,RNA 的最小長(zhǎng)度單位)處,RNA Pol II 會(huì)被暫時(shí)卡住,機(jī)制后面講。eRNA 可以充當(dāng) NELF 這個(gè)暫停因子的誘餌 RNA,誘使 NELF 離開(kāi) Pol II,讓 Pol II 重新跑起來(lái)。

第三,捕獲并穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子。eRNA 可以增加 YY1(Yin Yang 1,一種廣泛表達(dá)的鋅指型轉(zhuǎn)錄因子蛋白)、BRD4(bromodomain-containing protein 4,含溴結(jié)構(gòu)域蛋白 4,后面詳述)等關(guān)鍵蛋白在調(diào)控元件上的停留時(shí)間。

第四,調(diào)控染色質(zhì)修飾反饋環(huán)。eRNA 可激活 CBP 的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性,促進(jìn) H3K27ac 的沉積;同時(shí)抑制 PRC2 中 EZH2 的活性,阻止抑制性的 H3K27me3 沉積。eRNA 幫助增強(qiáng)子保持激活態(tài)。

第五,作為凝聚體的組分。eRNA 可以通過(guò)多價(jià)、弱相互作用,參與轉(zhuǎn)錄凝聚體的形成與維持。這一點(diǎn)在第 6 節(jié)深入討論。

eRNA 的發(fā)現(xiàn)極大地拓展了我們對(duì)增強(qiáng)子的認(rèn)知。它不是一段靜止的 DNA 標(biāo)簽,而是一個(gè)主動(dòng)產(chǎn)生 RNA 的、活躍的功能單元。

4. 轉(zhuǎn)錄因子與共激活因子的招募

增強(qiáng)子要發(fā)揮作用,必須招募一支工作團(tuán)隊(duì)。

先頭部隊(duì)是序列特異性轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor, TF),一類(lèi)能識(shí)別 DNA 上特定序列(像識(shí)別鑰匙的鎖眼)的蛋白質(zhì)。每種 TF 有自己識(shí)別的序列偏好,這就解釋了為什么不同細(xì)胞、不同狀態(tài)下激活的增強(qiáng)子集合是不同的,因?yàn)椴煌募?xì)胞表達(dá)不同的 TF。

TF 不是單打獨(dú)斗,它們的活性區(qū)(activation domain)往往是一段內(nèi)稟無(wú)序區(qū)(intrinsically disordered region, IDR)。IDR 是沒(méi)有固定三維結(jié)構(gòu)、靈活松散的蛋白質(zhì)段,后面會(huì)反復(fù)出現(xiàn),因?yàn)樗窍喾蛛x機(jī)制的核心。

TF 招來(lái)的工人包括幾個(gè)核心角色。

Mediator(中介復(fù)合物)是由約 26 個(gè)亞基組成的巨型蛋白復(fù)合物,分為 Head、Middle、Tail 和 Kinase 四個(gè)模塊。TF 通過(guò)激活區(qū)直接結(jié)合 Mediator 的 Tail 模塊(主要是 MED1、MED14、MED15 這幾個(gè)亞基);Mediator 再向下游伸出手臂,聯(lián)系 RNA Pol II 和其他通用轉(zhuǎn)錄因子。它是一個(gè)總承包商,把上游的 TF 信號(hào)翻譯成下游轉(zhuǎn)錄機(jī)器能聽(tīng)懂的指令。

CBP/p300 是一對(duì)功能高度相似的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶,負(fù)責(zé)催化 H3K27ac。它們既識(shí)別 TF、又給 TF 本身加上乙酰修飾,還把組蛋白尾巴改造得更開(kāi)放。

BRD4 是一個(gè)明星蛋白分子。它有兩個(gè) bromodomain(簡(jiǎn)稱(chēng) BD1、BD2),專(zhuān)門(mén)識(shí)別已經(jīng)被乙酰化的賴(lài)氨酸,無(wú)論是組蛋白上的還是 TF 上的。所以 BRD4 像一個(gè)乙酰化雷達(dá),一旦增強(qiáng)子被 H3K27ac 標(biāo)記,BRD4 就被招來(lái)。BRD4 的 C 端還有一段 P-TEFb 互作結(jié)構(gòu)域,可以把 P-TEFb(positive transcription elongation factor b,正性轉(zhuǎn)錄延伸因子 b,由 CDK9 激酶和 Cyclin T1 組成的蛋白復(fù)合物)拉到現(xiàn)場(chǎng)。P-TEFb 是負(fù)責(zé)啟動(dòng) RNA Pol II 真正開(kāi)始干活的鑰匙,詳見(jiàn)第二章關(guān)于啟動(dòng)子近端暫停。

把這一連串關(guān)系串起來(lái):TF 識(shí)別增強(qiáng)子 DNA,招來(lái) CBP/p300 把組蛋白和 TF 自己都乙酰化,BRD4 通過(guò) bromodomain 鎖定這些乙酰化標(biāo)簽,再把 P-TEFb 拉過(guò)來(lái),P-TEFb 釋放被卡住的 Pol II,轉(zhuǎn)錄開(kāi)始。

此外,MLL4(KMT2D)和譜系決定 TF 是搭檔關(guān)系。TF 把 MLL4 帶到增強(qiáng)子,MLL4 沉積 H3K4me1/2 標(biāo)簽,同時(shí)招募 p300、Mediator、Pol II。各種共激活因子之間是相互勾連的網(wǎng)絡(luò),而不是依次到場(chǎng)的單兵。

5. 增強(qiáng)子與啟動(dòng)子的遠(yuǎn)距離對(duì)話(huà)

現(xiàn)在可以正面回答開(kāi)篇的距離之謎:增強(qiáng)子和啟動(dòng)子相隔數(shù)十 kb 甚至幾個(gè) Mb,它們?cè)鯓咏⒙?lián)系?

Cohesin 與環(huán)擠出機(jī)制

想象 DNA 是一根長(zhǎng)長(zhǎng)的繩子。Cohesin 是一個(gè)環(huán)形蛋白復(fù)合物,由 SMC1、SMC3、RAD21、STAG1/2 幾個(gè)亞基組成,形狀真的就像一個(gè)戒指。Cohesin 由 NIPBL/MAU2 蛋白裝載到 DNA 上,由 WAPL 蛋白卸下。它做的事可以這樣想象:像吸管吸面條,用 ATP 提供能量,沿著染色質(zhì)雙向擠出一個(gè) DNA 環(huán)。環(huán)越來(lái)越大,直到撞到某個(gè)路障才停下來(lái)。這個(gè)過(guò)程叫環(huán)擠出(loop extrusion)。

那么路障是什么?是 CTCF(CCCTC-binding factor)這個(gè)蛋白。CTCF 結(jié)合在 DNA 上特定的序列上,像沿途插著方向性的路標(biāo)。Cohesin 沿 DNA 滑行時(shí),只有遇到方向收斂(兩個(gè) CTCF 頭對(duì)頭)的兩個(gè)位點(diǎn)才會(huì)被卡住。這一卡,就形成了一個(gè)穩(wěn)定的染色質(zhì)環(huán)。

由這種機(jī)制大量產(chǎn)生的染色質(zhì)環(huán)集合,在 Hi-C 實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為一個(gè)個(gè)自相互作用頻率高的方塊,被稱(chēng)為拓?fù)潢P(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域(topologically associating domain, TAD)。TAD 內(nèi)部的 DNA 段彼此頻繁接觸,而跨越 TAD 邊界的接觸則被強(qiáng)烈抑制。

這一機(jī)制對(duì)增強(qiáng)子與啟動(dòng)子對(duì)話(huà)的意義是什么? Cohesin 的環(huán)擠出過(guò)程會(huì)在 TAD 內(nèi)部反復(fù)掃描,把原本相距數(shù)百 kb 的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子拉到一起的概率大大提高。CTCF 設(shè)定的邊界則像絕緣墻,保證增強(qiáng)子不會(huì)誤激活另一個(gè) TAD 里的基因。事實(shí)上即使只有一個(gè) CTCF 位點(diǎn),也足以阻止增強(qiáng)子的劫持(Hemming/Bernstein, Mol Cell 2024)。急性敲除 RAD21 或 NIPBL,遠(yuǎn)距離增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄會(huì)迅速衰減,這是 cohesin 環(huán)擠出機(jī)制因果性的有力證據(jù)。

這套機(jī)制的核心(cohesin 形成環(huán) + CTCF 路障)已被 2019 年的單分子熒光實(shí)驗(yàn)直接觀(guān)察證實(shí)(Davidson 等、Kim 等,Science 2019),目前是領(lǐng)域共識(shí);不過(guò)擠出速率、cohesin 包繞 DNA 的具體拓?fù)湫问降燃?xì)節(jié)仍在精細(xì)化研究中。

下圖示意整個(gè)過(guò)程:

圖 1:Cohesin 環(huán)擠出機(jī)制示意 接觸模型與通信模型

經(jīng)典的接觸模型(contact model)認(rèn)為增強(qiáng)子必須與啟動(dòng)子物理接觸才能起效,就像必須按下開(kāi)關(guān)燈才會(huì)亮。但近年來(lái)活細(xì)胞單分子成像給出了讓人困惑的數(shù)據(jù):物理上的鄰近與轉(zhuǎn)錄爆發(fā)并不嚴(yán)格同步。即使增強(qiáng)子和啟動(dòng)子已經(jīng)被拉得很近,基因也不一定立刻表達(dá);有時(shí)它們短暫分開(kāi),基因卻繼續(xù)表達(dá)。

這催生了通信模型(communication model)或 hub/凝聚體模型:增強(qiáng)子可能不需要持續(xù)物理接觸啟動(dòng)子,而是通過(guò)形成局部的分子云(凝聚體),把轉(zhuǎn)錄所需的所有材料富集到一個(gè)區(qū)域,啟動(dòng)子只需進(jìn)入這個(gè)云區(qū)附近即可被激活。

最新的整合模型(Mach 等 2025)給出了一個(gè)調(diào)和的答案:cohesin 環(huán)擠出制造稀少但延長(zhǎng)的接觸機(jī)會(huì),轉(zhuǎn)錄因子凝聚體在這個(gè)機(jī)會(huì)窗口里捕獲啟動(dòng)子,觸發(fā)轉(zhuǎn)錄爆發(fā)。換句話(huà)說(shuō)接觸是必要的但不是持續(xù)的,凝聚體把短暫接觸放大為有效信號(hào)。這正好對(duì)應(yīng)開(kāi)篇的距離之謎,答案不是近或遠(yuǎn)二選一,而是兩種機(jī)制的協(xié)奏。

6. 相分離與轉(zhuǎn)錄凝聚體

接下來(lái)講一個(gè)近七年來(lái)最革命性的概念。

什么是液–液相分離(liquid-liquid phase separation, LLPS)? 用一個(gè)家常的比方,沙拉醬里油和醋會(huì)分層,這就是相分離。在細(xì)胞內(nèi),某些蛋白質(zhì)和 RNA 在合適濃度下也會(huì)自發(fā)凝聚成液滴,與周?chē)暮藵{界限分明,但內(nèi)部分子仍能自由流動(dòng)。這種液滴不是細(xì)胞器(沒(méi)有膜),卻能富集特定分子、加速反應(yīng),可以想象成沒(méi)有圍墻的廚房,把所有炊具和食材集中在一塊小空間里。

Sabari、Boija、Cho 等(Cell 2018;Science 2018)的關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)是 BRD4 和 MED1(Mediator 的核心亞基)的 IDR 可以在超級(jí)增強(qiáng)子上形成液滴狀的轉(zhuǎn)錄凝聚體(transcriptional condensate),富集 RNA Pol II、P-TEFb 以及 TF 的激活區(qū)。

為什么 IDR 能驅(qū)動(dòng)相分離? IDR 像一段段靈活的魔術(shù)貼,它們之間能形成大量弱的、多價(jià)的相互作用,包括 π–π 堆積、電荷–π 作用、芳香環(huán)疏水互作。任何一對(duì)相互作用都很弱、很短暫,但當(dāng)幾百幾千個(gè)這樣的弱相互作用同時(shí)發(fā)生,整體效果就足以把這些分子粘成一團(tuán)液滴。

RNA Pol II 的 C 端結(jié)構(gòu)域(CTD)本身就是一段經(jīng)典的 IDR,人類(lèi) RNA Pol II 的 CTD 含有 52 個(gè) YSPTSPS 七肽重復(fù)。這段 IDR 的 Ser5 到 Ser2 磷酸化梯度引導(dǎo) Pol II 從啟動(dòng)子凝聚體遷移到 mRNA 加工凝聚體,這是一個(gè)分子在不同液滴間換工位的精妙過(guò)程。

BRD4 的故事更精彩。它有長(zhǎng)短兩種異構(gòu)體(BRD4L 和 BRD4S),兩者形成不同性質(zhì)的凝聚體(Han 等,Nat Struct Mol Biol 2020)。BRD4 通過(guò)雙 bromodomain 錨定乙酰化的 H3K27ac,把凝聚體牢牢綁定在 SE 上。

這個(gè)模型完美解釋了多個(gè)觀(guān)察現(xiàn)象。SE 比普通增強(qiáng)子強(qiáng)這么多,是因?yàn)?SE 上 BRD4/MED1 濃度足夠高,能夠觸發(fā)相分離的臨界濃度閾值,形成凝聚體;普通增強(qiáng)子達(dá)不到這個(gè)閾值,只能進(jìn)行低強(qiáng)度的招募。這正是開(kāi)篇強(qiáng)度之謎的答案。SE 表現(xiàn)出閾值效應(yīng)、一旦破壞就崩塌,是因?yàn)橄喾蛛x本身就是非線(xiàn)性的,濃度剛過(guò)閾值就突然成相,剛過(guò)不了就完全不成相。BET 抑制劑(JQ1)對(duì)癌細(xì)胞如此致命,是因?yàn)樗?BRD4 從乙酰化染色質(zhì)上踢下來(lái),凝聚體隨即解體,SE 驅(qū)動(dòng)的致癌程序整個(gè)崩潰。

凝聚體模型是理解癌癥轉(zhuǎn)錄依賴(lài)性(transcriptional addiction)的關(guān)鍵鑰匙,這一點(diǎn)在第四章深入展開(kāi)。

7. 增強(qiáng)子的鑒定與功能驗(yàn)證

講到這里已經(jīng)理解了增強(qiáng)子的工作原理,現(xiàn)在來(lái)看實(shí)驗(yàn)上怎么找到它們、怎么驗(yàn)證它們的功能。

鑒定活性增強(qiáng)子的標(biāo)準(zhǔn)做法是 H3K27ac 的 ChIP-seq,在全基因組范圍掃描這一活性標(biāo)簽的分布,然后用 ROSE 算法把信號(hào)排序,挑出超級(jí)增強(qiáng)子。H3K4me1 ChIP-seq 幫助區(qū)分預(yù)備態(tài)與活性態(tài),ATAC-seq 或 DNase-seq 檢測(cè)染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域(暗示有蛋白結(jié)合)。

eRNA 的檢測(cè)則需要專(zhuān)門(mén)捕捉短半衰期、不穩(wěn)定 RNA 的技術(shù),如 GRO-seq(global run-on sequencing)、PRO-seq(precision run-on sequencing)、CAGE(cap analysis gene expression)。這些技術(shù)能看到正在被 RNA Pol II 轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn),是判斷增強(qiáng)子是否活躍的金標(biāo)準(zhǔn)之一。

TF 與共激活因子的占據(jù)可以用各自的 ChIP-seq 來(lái)定位,BRD4、MED1、p300、各種主導(dǎo) TF 的 ChIP-seq 既鑒定增強(qiáng)子位置,也用于 SE 排序。

三維基因組學(xué)是最近的突破方向。Hi-C 給出全局拓?fù)鋱D;ChIA-PET 和 HiChIP(尤其 H3K27ac HiChIP)富集特定蛋白介導(dǎo)的染色質(zhì)環(huán);Capture Hi-C 對(duì)感興趣的啟動(dòng)子做高分辨率放大調(diào)研;Micro-C 把分辨率推到約 200 bp。這些方法讓我們能直接看見(jiàn)增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的三維擁抱。最近的工具如 HiC-DC+ 還能做差異接觸分析。

RNA 鄰近捕獲技術(shù)從 DNA-DNA 接觸擴(kuò)展到 RNA 介導(dǎo)的接觸。Hi-C 系列回答的是哪兩段 DNA 在空間上鄰近,但忽視了 RNA 在染色質(zhì)組織中的角色。前面講過(guò) eRNA、lncRNA 都參與穩(wěn)定增強(qiáng)子–啟動(dòng)子環(huán)、參與凝聚體形成。要直接捕獲 RNA 介導(dǎo)的空間互作,需要一類(lèi)全新的技術(shù)。

RIC-seq(RNA In situ Conformation sequencing,RNA 原位構(gòu)象測(cè)序)由薛愿超實(shí)驗(yàn)室在 2020 年的 Nature 論文中首次報(bào)道。原理是在細(xì)胞核內(nèi)原位連接兩條空間上鄰近的 RNA 分子,然后建庫(kù)測(cè)序。它與 Hi-C 的關(guān)鍵區(qū)別是:Hi-C 捕捉 DNA-DNA 接觸,RIC-seq 捕捉 RNA-RNA 在原位的空間鄰近。這讓研究者第一次能直接看見(jiàn)某個(gè) eRNA 與它調(diào)控的靶基因 mRNA 是不是真的在三維空間里相遇。在腫瘤研究中,RIC-seq 已被用來(lái)揭示癌癥中 eRNA / lncRNA 介導(dǎo)的異常染色質(zhì)互作,以及 eRNA-mRNA 互作如何影響轉(zhuǎn)錄爆發(fā)。

GRID-seq(Global RNA Interactions with DNA by deep sequencing)捕捉 RNA 與 DNA 的全局互作圖譜,反向告訴我們某個(gè) RNA 占據(jù)了基因組的哪些位置。RADICL-seq、ChAR-seq、MARGI 是同類(lèi)原理的變體,各自有不同的連接策略與分辨率特征,共同構(gòu)成 RNA-染色質(zhì)互作組工具箱。

這些 RNA 鄰近捕獲技術(shù)之所以重要,是因?yàn)樗鼈兲峁┝?Hi-C 無(wú)法給出的關(guān)鍵信息:某個(gè)非編碼 RNA 是不是真的親臨現(xiàn)場(chǎng)參與了一對(duì)增強(qiáng)子-啟動(dòng)子的功能性偶聯(lián)。這對(duì)驗(yàn)證 eRNA 功能假說(shuō)、研究 lncRNA 介導(dǎo)的致癌機(jī)制(如 HOTAIR、CCAT1 等)是不可替代的工具。

功能驗(yàn)證則需要擾動(dòng)實(shí)驗(yàn)。CRISPRi-FlowFISH(用 dCas9-KRAB 沉默候選增強(qiáng)子,然后用 FISH 檢測(cè)下游基因表達(dá)變化)、CRISPR knockout(直接刪除增強(qiáng)子序列)、MPRA(massively parallel reporter assay,大規(guī)模并行報(bào)告基因?qū)嶒?yàn))等。僅有共定位的相關(guān)性不夠,功能性的因果證據(jù)才是定論。

二、啟動(dòng)子的分子機(jī)制 1. 結(jié)構(gòu)與核心元件

啟動(dòng)子和增強(qiáng)子一樣本身就是一段 DNA 序列。如果增強(qiáng)子是遠(yuǎn)程調(diào)光器,啟動(dòng)子就是大樓門(mén)口的開(kāi)關(guān),直接決定基因從哪里開(kāi)始轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄多頻繁。

啟動(dòng)子按距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcription start site, TSS)的遠(yuǎn)近,可分為三層。核心啟動(dòng)子(core promoter)位于 TSS 周?chē)s ±40 bp 的區(qū)域,負(fù)責(zé)招募 RNA Pol II 與通用轉(zhuǎn)錄因子,是轉(zhuǎn)錄起始的反應(yīng)中心。近端啟動(dòng)子(proximal promoter)位于 TSS 上游約 ?250 bp 內(nèi),常含有特異 TF 的結(jié)合位點(diǎn)。遠(yuǎn)端調(diào)控元件包括增強(qiáng)子、絕緣子、沉默子等,從功能上又回到了增強(qiáng)子的話(huà)題。

核心啟動(dòng)子內(nèi)部有一些標(biāo)志性序列元件,像蓋樓時(shí)埋的地基榫卯,標(biāo)識(shí)開(kāi)關(guān)的位置。

TATA box,共識(shí)序列 TATAWAAR,位于 ?25/?31 區(qū)域,由 TBP(TATA-binding protein,TATA 結(jié)合蛋白)識(shí)別。約 10 到 20% 的人類(lèi)啟動(dòng)子有 TATA box,常見(jiàn)于誘導(dǎo)型、組織特異型基因。

Inr(initiator,起始元件)共識(shí)序列 YYANWYY,A 在 +1(也就是 TSS 上)。由 TFIID 復(fù)合物中的 TAF1/TAF2 亞基識(shí)別,可以獨(dú)立啟動(dòng) PIC,也可與 TATA 協(xié)同。

DPE(downstream promoter element)共識(shí)序列 RGWYV,位于 +28/+32。它與 Inr 嚴(yán)格協(xié)同(距離不能變),常見(jiàn)于無(wú) TATA 的果蠅啟動(dòng)子。

MTE、BRE、TCT 等是其他較少見(jiàn)的核心元件,各有專(zhuān)門(mén)的識(shí)別因子。

CpG island(CpG 島)約覆蓋 60 到 70% 的人類(lèi)啟動(dòng)子。它們是富含 CG 二核苷酸的區(qū)段,通常沒(méi)有 TATA box,但富含 GC box(被 Sp1 等 TF 識(shí)別),并且呈現(xiàn)雙向轉(zhuǎn)錄特性。最近還發(fā)現(xiàn)一種叫 CGCG element 的 CpG 島核心元件(共識(shí) TCTCGCGAGA),可能是 CGI 啟動(dòng)子的方向性激活因子。

2. PIC 組裝

前起始復(fù)合物(pre-initiation complex, PIC)是 RNA Pol II 啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄前必須組裝的多組分機(jī)器。讓我把這場(chǎng)組裝過(guò)程用畫(huà)面化的方式描述出來(lái)。

想象一段 DNA 上有個(gè) TATA box 等待被識(shí)別。組裝開(kāi)始。

第一位到場(chǎng)的是 TFIID,一個(gè)由 TBP 加 13 個(gè) TAF 蛋白組成的龐大復(fù)合物。TBP 像一只手以反常的方式彎折 DNA,不讓 DNA 進(jìn)入自己的凹槽,而是騎跨在 DNA 上把它彎曲約 90 度。這個(gè)戲劇性的彎折是后續(xù)一切組裝的幾何基礎(chǔ)。TFIID 不只識(shí)別 TATA,也通過(guò) TAF 亞基識(shí)別 Inr、DPE、MTE。

第二位到場(chǎng)的是 TFIIA,工作很簡(jiǎn)單:穩(wěn)定 TBP 與 DNA 這個(gè)易碎的彎折結(jié)構(gòu),防止它在后續(xù)步驟里散架。

接著 TFIIB 上場(chǎng)扮演橋梁工,一頭接 TBP 一頭接即將到來(lái)的 RNA Pol II,確定 Pol II 的方向(讓它面向下游而不是上游)。

RNA Pol II 與 TFIIF 一起進(jìn)場(chǎng),TFIIF 的作用是抓穩(wěn) Pol II,讓它正確就位在彎折的 DNA 上。

TFIIE 加入,招呼下一位嘉賓。

TFIIH 是最后一位也是最忙的玩家,包含兩個(gè)關(guān)鍵活性。一個(gè)是 XPB 解旋酶,消耗 ATP 強(qiáng)行把 DNA 雙鏈拉開(kāi)約 11 到 13 bp,形成所謂的轉(zhuǎn)錄泡(transcription bubble),讓 Pol II 接觸到模板鏈。另一個(gè)是 CDK7 激酶(也叫 CAK 模塊),磷酸化 Pol II CTD 的 Ser5 殘基,這個(gè)磷酸化是 Pol II 離開(kāi)啟動(dòng)子、開(kāi)始向下游延伸的發(fā)車(chē)信號(hào)。

到此 PIC 組裝完成,但故事還沒(méi)結(jié)束。Mediator 復(fù)合物作為總管穿梭在整個(gè)組裝過(guò)程中,通過(guò) Tail 模塊接收上游 TF 的激活信號(hào),通過(guò) Head 和 Middle 模塊聯(lián)系 PIC 各組件,把上游決定翻譯成下游行動(dòng)。Mediator 還有一個(gè)可拆卸的 Kinase 模塊(包含 CDK8/19、CCNC、MED12/13),能可逆地阻止 Mediator 與 PIC 結(jié)合,這是一個(gè)微妙的調(diào)控開(kāi)關(guān),在腫瘤治療中后面會(huì)再次出現(xiàn)。

整個(gè) PIC 組裝過(guò)程是 Patrick Cramer、Steve Hahn、Eva Nogales 等結(jié)構(gòu)生物學(xué)家通過(guò)冷凍電鏡近十年解析出來(lái)的。冷凍電鏡讓我們第一次看見(jiàn)了這場(chǎng)分子之舞。

3. 啟動(dòng)子與增強(qiáng)子的兼容性

回到開(kāi)篇的特異性之謎:增強(qiáng)子怎么知道該激活哪個(gè)啟動(dòng)子?研究提出幾個(gè)層次的機(jī)制。

生化兼容性方面,不同的啟動(dòng)子對(duì)不同的共激活因子(p300 vs Mediator vs MLL)有不同偏好。果蠅實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) TATA-containing 啟動(dòng)子和 DPE-containing 啟動(dòng)子分別響應(yīng)不同類(lèi)型的增強(qiáng)子,哺乳動(dòng)物中也存在類(lèi)似的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子類(lèi)型匹配。

空間架構(gòu)方面,TAD 內(nèi)部接觸概率高、跨 TAD 概率低,這是幾何學(xué)層面的過(guò)濾器。

染色質(zhì)狀態(tài)匹配方面,帶 H3K27ac 的活性增強(qiáng)子優(yōu)先與 CpG 島啟動(dòng)子配對(duì);被 Polycomb 沉默的啟動(dòng)子對(duì)增強(qiáng)子無(wú)響應(yīng)。

凝聚體兼容性方面,同一相分離 hub 內(nèi)的 IDR 必須性格相投(化學(xué)相容性)才能共存,這是生物物理層面的過(guò)濾。

最新模型支持序列編碼的特異性與三維兼容性互補(bǔ),它們不是非此即彼而是協(xié)同工作。

4. 啟動(dòng)子近端暫停

這里有一個(gè)反直覺(jué)的事實(shí):RNA Pol II 啟動(dòng)后并不會(huì)一路狂奔,而是會(huì)在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游 30 到 60 nt 處被卡住,形成所謂的啟動(dòng)子近端暫停(promoter-proximal pausing)。

為什么細(xì)胞要讓 Pol II 暫停? 進(jìn)化生物學(xué)的答案是這給了細(xì)胞一個(gè)最后的速率調(diào)控點(diǎn):已經(jīng)投入資源啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,但要不要真正生產(chǎn) mRNA,還可以臨場(chǎng)決定。

讓 Pol II 暫停的關(guān)鍵因子有兩個(gè)。NELF(negative elongation factor,負(fù)性延伸因子)是一個(gè)由 NELF-A/B/C/E 組成的四聚體蛋白復(fù)合物,把暫停態(tài)穩(wěn)定下來(lái),NELF-E 通過(guò)一個(gè)堿性螺旋結(jié)構(gòu)接觸下游 DNA,把 Pol II 釘在原地。DSIF 由 SPT4 和 SPT5 組成,與 NELF 協(xié)同穩(wěn)定暫停態(tài)。Pol II 下游的第一個(gè)核小體(稱(chēng)為 +1 核小體)也充當(dāng)物理屏障。

釋放暫停的鑰匙是 P-TEFb。P-TEFb 經(jīng) BRD4 或 SEC(super elongation complex,超級(jí)延伸復(fù)合物,含 AFF1/AFF4、ELL、ENL、AF9 的蛋白復(fù)合物)招募到基因座,做三件事。第一,磷酸化 Pol II CTD 的 Ser2,這是開(kāi)始真正延伸的信號(hào)(對(duì)照 Ser5 是啟動(dòng)子逃逸信號(hào))。第二,磷酸化 DSIF 的 SPT5 CTR 結(jié)構(gòu)域,把 DSIF 從負(fù)性因子改造成正性延伸因子,同一個(gè)分子在被改造后角色翻轉(zhuǎn)。第三,磷酸化 NELF-E 使 NELF 解離,釋放 Pol II。經(jīng)過(guò)這三步 Pol II 進(jìn)入生產(chǎn)性延伸態(tài),真正開(kāi)始合成 mRNA。

P-TEFb 自身也受調(diào)控。大部分 P-TEFb 被一個(gè)叫 7SK snRNP 的核糖核蛋白復(fù)合物(由 7SK RNA 加 HEXIM1/2、LARP7、MePCE 幾個(gè)蛋白組成)隔離起來(lái),處于待命狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞需要轉(zhuǎn)錄時(shí) 7SK 釋放 P-TEFb,后者被 BRD4 或 SEC 捕獲到基因座。這套層層調(diào)控讓 P-TEFb 成為一個(gè)精密的流量閥。

值得一提的是 NELF 僅存在于后生動(dòng)物。這意味著 CDK9 抑制劑的效應(yīng)在不同物種、甚至不同細(xì)胞背景下有別。NELF 陽(yáng)性的細(xì)胞在 CDK9 抑制下整體關(guān)閉轉(zhuǎn)錄,而 NELF 缺失的細(xì)胞繼續(xù)生成非生產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄(Aoi 等,Nat Commun 2023)。

5. 啟動(dòng)子的表觀(guān)遺傳調(diào)控

CpG island 甲基化是腫瘤中的一個(gè)核心機(jī)制。正常情況下 CGI 啟動(dòng)子保持低甲基化,在腫瘤中 DNMT3A/3B(DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶)通過(guò) PWWP 結(jié)構(gòu)域被招募到 H3K36me3 標(biāo)記的區(qū)域,在那里發(fā)動(dòng)新發(fā)(de novo)甲基化。被甲基化的 CGI 啟動(dòng)子招募 MBD 蛋白家族,后者再招募 HDAC 和 PRC2,導(dǎo)致基因永久沉默。

這就是為什么很多抑癌基因(tumor suppressor gene, TSG)在腫瘤中是通過(guò)啟動(dòng)子高甲基化沉默的,而不是序列突變。MLH1 是錯(cuò)配修復(fù)基因,高甲基化導(dǎo)致 MSI-H(微衛(wèi)星不穩(wěn)定)結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌。CDKN2A/p16 是細(xì)胞周期抑制因子,高甲基化讓腫瘤跳過(guò)衰老屏障。BRCA1 是同源重組修復(fù)基因,高甲基化造成同源重組缺陷型乳腺癌。MGMT 是 DNA 修復(fù)酶,高甲基化使膠質(zhì)瘤對(duì)替莫唑胺敏感。VHL 是抑癌基因,高甲基化是腎癌發(fā)生的早期事件。

啟動(dòng)子的活性標(biāo)簽是 H3K4me3(注意與增強(qiáng)子的 H3K4me1 區(qū)別:三甲基 vs 單甲基),由 SET1A/B 與 MLL1/MLL2 催化。

發(fā)育基因常處于一種叫雙價(jià)(bivalent)的狀態(tài),同時(shí)攜帶激活的 H3K4me3 和抑制的 H3K27me3。這就像同時(shí)踩著油門(mén)和剎車(chē),只待分化信號(hào)一來(lái)就快速被切換為完全激活或完全沉默。這個(gè)機(jī)制讓胚胎干細(xì)胞擁有發(fā)育多能性。

6. 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄與雙向性

回到一個(gè)根本問(wèn)題:啟動(dòng)子本身是否被轉(zhuǎn)錄? 答案是肯定的。啟動(dòng)子就是 RNA Pol II 轉(zhuǎn)錄起始的位置。事實(shí)上啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄在結(jié)構(gòu)上與增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄高度對(duì)稱(chēng)。

經(jīng)典視角下我們以為啟動(dòng)子只產(chǎn)生 mRNA,但 Andersson 等(Nature 2014)的研究改變了這個(gè)認(rèn)識(shí)。在啟動(dòng)子的中心 NDR 上,RNA Pol II 實(shí)際上是雙向起始的。沿基因方向產(chǎn)生 mRNA,反向則產(chǎn)生一類(lèi)叫 PROMPT(promoter upstream transcript,啟動(dòng)子上游轉(zhuǎn)錄本)或 uaRNA(upstream antisense RNA,上游反義 RNA)的轉(zhuǎn)錄本,通常被外泌體快速降解。

啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄與增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄的初始事件幾乎相同,真正的差別在下游加工。沿基因方向的 RNA 攜帶剪接位點(diǎn)和 poly(A) 信號(hào),被剪接和加尾保護(hù)、穩(wěn)定輸出為 mRNA;反方向的 PROMPT 缺乏這些信號(hào),與 eRNA 一樣命短,被外泌體清除。

約 11% 的人類(lèi)基因頭對(duì)頭分布在 1 kb 以?xún)?nèi)的共享啟動(dòng)子區(qū),常常是 CGI 啟動(dòng)子,這種結(jié)構(gòu)稱(chēng)為雙向啟動(dòng)子(bidirectional promoter),其兩端都驅(qū)動(dòng)穩(wěn)定 mRNA。

這一對(duì)稱(chēng)性正是 Andersson 模型把啟動(dòng)子與增強(qiáng)子統(tǒng)一起來(lái)的基礎(chǔ):所有順式調(diào)控元件本質(zhì)上都是雙向轉(zhuǎn)錄起點(diǎn),差別只在于產(chǎn)物的穩(wěn)定性和功能性。增強(qiáng)子的 eRNA 與啟動(dòng)子的 PROMPT 是同源現(xiàn)象,只是命名不同。

三、增強(qiáng)子-啟動(dòng)子相互作用的整合理解 1. 接觸模型與通信模型再討論

經(jīng)典接觸模型(Bulger & Groudine, 2011)主張?jiān)鰪?qiáng)子必須與啟動(dòng)子物理接觸才能激活轉(zhuǎn)錄,證據(jù)是 Hi-C 和 3C 實(shí)驗(yàn)顯示活性 E-P 對(duì)在三維空間中頻繁接觸。

修正后出現(xiàn)了兩種模型。Hub/瞬時(shí)模型認(rèn)為 E 與 P 的接觸是短時(shí)多元的,不是穩(wěn)定的二者牽手,多個(gè)增強(qiáng)子和啟動(dòng)子可能形成一個(gè)小社區(qū)彼此動(dòng)態(tài)接觸。凝聚體/遠(yuǎn)程通信模型認(rèn)為 E 不需要持續(xù)接觸 P,而是通過(guò)形成凝聚體把轉(zhuǎn)錄材料富集起來(lái),P 進(jìn)入凝聚體附近即被激活。

最新的整合模型(Mach 等 2024,基于活細(xì)胞成像)認(rèn)為 cohesin 環(huán)擠出制造罕見(jiàn)但壽命較長(zhǎng)的接觸機(jī)會(huì),凝聚體在這個(gè)機(jī)會(huì)窗口里捕獲兩端,觸發(fā)轉(zhuǎn)錄爆發(fā)(burst)。增強(qiáng)子主要影響 burst frequency(爆發(fā)頻率)而不是 burst size(爆發(fā)幅度),讓基因更頻繁地開(kāi)火,但每次開(kāi)火釋放的 mRNA 量相對(duì)恒定。

2. 特異性如何決定

把上面所有討論合成一個(gè)分層模型。

第一層是空間過(guò)濾:cohesin 環(huán)擠出在 TAD 內(nèi)部掃描,把 E 和 P 的接觸概率從基線(xiàn)提升至顯著水平,TAD 邊界 CTCF 限制范圍。第二層是序列過(guò)濾:E 上 TF 與 P 上 GTF/Pol II 的兼容性,比如 TATA 啟動(dòng)子和 DPE 啟動(dòng)子分別響應(yīng)不同增強(qiáng)子。第三層是染色質(zhì)狀態(tài)過(guò)濾:核小體定位、H3K27ac、eRNA 的存在與否決定哪些潛在接觸對(duì)能產(chǎn)生功能信號(hào)。第四層是凝聚體過(guò)濾:IDR 兼容性決定 E 和 P 能否共存于同一相分離 hub。

每一層都是過(guò)濾器,層層下來(lái)最終形成的特異 E-P 配對(duì)就是穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄信號(hào)。

3. eRNA 在 E-P 互作中的作用

如前所述,eRNA 既穩(wěn)定 cohesin/Mediator 介導(dǎo)的染色質(zhì)環(huán),也參與凝聚體的多價(jià)相互作用。它把序列特異性轉(zhuǎn)化為生物物理協(xié)調(diào)性,是連接基因組學(xué)層面與生物物理層面的重要橋梁。

4. TF 凝聚體介導(dǎo)的 E-P 通信

Mediator-SE-Pol II 凝聚體可以被理解為 E 和 P 的會(huì)面艙。E 端 TF 通過(guò) IDR 招募 BRD4/MED1,引發(fā)凝聚體形成;P 端 Pol II 通過(guò) CTD(本身是 IDR)進(jìn)入同一相;結(jié)果是 E 和 P 即使沒(méi)有持續(xù)物理接觸,也能通過(guò)共享同一個(gè)凝聚體而功能耦合。

這個(gè)模型解釋了 SE 的魯棒性、閾值效應(yīng),也解釋了為什么 BET、CDK7 抑制能過(guò)敏感地崩潰癌細(xì)胞 SE 程序,因?yàn)樗鼈兺呓獾氖沁@個(gè)凝聚體本身。

5. 染色質(zhì)重塑復(fù)合物

要讓增強(qiáng)子和啟動(dòng)子被識(shí)別,首先它們必須暴露,也就是核小體得讓開(kāi)。這個(gè)工作由染色質(zhì)重塑復(fù)合物(chromatin remodelers)完成,它們是利用 ATP 推動(dòng)核小體的多亞基蛋白復(fù)合物。

SWI/SNF(也叫 BAF)家族最為重要,有三個(gè)亞型。cBAF 含 ARID1A/1B、SMARCA4/2(BRG1/BRM)、SMARCB1、DPF 等。PBAF 含 ARID2、PBRM1、BRD7、PHF10 等。ncBAF/GBAF 含 BRD9、GLTSCR1 等。BAF 的主要功能是維持譜系特異性增強(qiáng)子的可及性和 H3K27ac。BAF 缺失會(huì)讓 H3K27ac 全面降低,導(dǎo)致譜系增強(qiáng)子塌陷,這一點(diǎn)在腫瘤中尤其重要。

ISWI、CHD、INO80 家族輔助完成核小體的精細(xì)定位,如 +1 核小體的精確放置。

NuRD/CoREST 復(fù)合物則反過(guò)來(lái),含 HDAC1/2 和 LSD1 介導(dǎo)基因沉默。一個(gè)有趣的現(xiàn)象是 BRD4 在某些情況下可以與 LSD1/NuRD 聯(lián)合,形成抑制性的反向 SE,這是乳腺癌耐藥的一個(gè)機(jī)制。

四、增強(qiáng)子/啟動(dòng)子在腫瘤中的作用機(jī)制

終于可以正面回答開(kāi)篇的致癌之謎:為什么調(diào)控元件異常會(huì)驅(qū)動(dòng)腫瘤? 為什么癌細(xì)胞表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄依賴(lài)? 癌細(xì)胞通過(guò)多種途徑綁架增強(qiáng)子/啟動(dòng)子系統(tǒng),讓它們持續(xù)輸出錯(cuò)誤的轉(zhuǎn)錄程序,下面分門(mén)別類(lèi)講解。

1. 致癌增強(qiáng)子劫持

正常情況下某個(gè)強(qiáng)增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)它附近的某個(gè)基因。如果發(fā)生染色體重排(易位、缺失、倒位、擴(kuò)增),這個(gè)增強(qiáng)子可能被搬到另一個(gè)原本不該被它調(diào)控的基因(通常是致癌基因)旁邊,這就叫 enhancer hijacking(增強(qiáng)子劫持)。結(jié)果是致癌基因被錯(cuò)誤地強(qiáng)力激活。

T-ALL 中 TAL1 的異常激活

TAL1 本來(lái)是在造血干細(xì)胞和紅系前體中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,在淋巴祖細(xì)胞中應(yīng)該是關(guān)閉的。但在 T 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病中 TAL1 被異常激活,這是 T-ALL 的一個(gè)標(biāo)志性事件。

激活 TAL1 的機(jī)制至少有三種,每種都涉及一個(gè)不同形式的增強(qiáng)子操縱。SIL-TAL1 缺失約占 30% 病例,約 90 kb 的缺失把 TAL1 直接置于上游 SIL 基因的普遍激活調(diào)控元件下。TCR-TAL1 易位約占 10%,TCR(T 細(xì)胞受體)位點(diǎn)的強(qiáng)增強(qiáng)子被劫持到 TAL1 旁。MuTE 突變(Mutation of TAL1 Enhancer)約占 5% 病例,這是最精彩的案例:在 TAL1 上游約 7.5 kb 處僅插入 2 個(gè)核苷酸(GT),就創(chuàng)造出一個(gè)全新的 MYB 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。這個(gè)位點(diǎn)招募 MYB-CBP-TAL1-GATA3-RUNX1-LMO1/2 復(fù)合物,形成一個(gè) de novo 超級(jí)增強(qiáng)子,驅(qū)動(dòng) TAL1 高表達(dá)(Mansour 等 Science 2014)。兩個(gè)核苷酸的插入引發(fā)一個(gè)超級(jí)增強(qiáng)子的誕生,再驅(qū)動(dòng)整個(gè) T-ALL 的轉(zhuǎn)錄程序,這是非編碼區(qū)調(diào)控元件突變可以驅(qū)動(dòng)腫瘤最經(jīng)典的證據(jù)之一。

值得一提的是 TAL1 復(fù)合體進(jìn)一步異常激活了進(jìn)化保守的 MYCN 遠(yuǎn)端增強(qiáng)子(enhMYCN),誘導(dǎo) MYCN 的轉(zhuǎn)錄,使 T-ALL 對(duì)甲羥戊酸(mevalonate)通路抑制劑敏感(Leukemia 2023)。這是個(gè)連鎖反應(yīng)的精彩例子。

MYC 增強(qiáng)子劫持的多種形式

MYC 是細(xì)胞增殖和代謝的主開(kāi)關(guān),幾乎在所有癌癥中都有異常表達(dá)。它的增強(qiáng)子被劫持有多種典型形式。

Burkitt 淋巴瘤中,t(8;14)(q24;q32) 易位把 MYC 重排到 IGH(免疫球蛋白重鏈)位點(diǎn)的內(nèi)含子或 3′ 調(diào)控區(qū),使 MYC 在 B 細(xì)胞的體細(xì)胞超突變(SHM)和類(lèi)別轉(zhuǎn)換重組(CSR)期間被 IgH 3′ 調(diào)控區(qū)持續(xù)激活,見(jiàn)于 85% 的 BL 病例。機(jī)制基礎(chǔ)是 AID(activation-induced cytidine deaminase,激活誘導(dǎo)脫氨酶)介導(dǎo)的 DNA 雙鏈斷裂。

多發(fā)性骨髓瘤中近 50% 的患者存在 MYC 重排,把 MYC 置于 IGH/IGL/IGK 或非 Ig 超級(jí)增強(qiáng)子(NSMCE2、TXNDC5、FAM46C 等)旁。

急性髓細(xì)胞白血病(AML)中,8q24 距離 MYC 1.7 Mb 處有一個(gè)由 9 個(gè)增強(qiáng)子模塊組成的 BENC(Blood ENhancer Cluster,血液增強(qiáng)子簇)。AML 中常見(jiàn) BENC 的焦點(diǎn)擴(kuò)增,把它轉(zhuǎn)化為 MYC 的超級(jí)增強(qiáng)子(Bahr/von Paleske et al., Nature 2018)。

前列腺癌中 8q24 基因荒漠區(qū)(gene desert)含 GWAS 風(fēng)險(xiǎn)變異(rs6983267、rs72725854),這些變異位于雄激素響應(yīng)增強(qiáng)子內(nèi),經(jīng) FoxA1/AR/SPDEF 介導(dǎo)加強(qiáng)與 MYC、PVT1、PCAT1 的環(huán)式接觸。

髓母細(xì)胞瘤中的 GFI1/GFI1B 劫持

Northcott/Pfister 等(Nature 2014)發(fā)現(xiàn) Group 3/4 髓母細(xì)胞瘤中 6.6% 病例存在 9q34 焦點(diǎn)重排,缺失/倒位/復(fù)制把 GFI1 或 GFI1B 編碼區(qū)并置于強(qiáng) SE 旁,產(chǎn)生互斥性 GFI1 或 GFI1B 高表達(dá),與 MYC 協(xié)同驅(qū)動(dòng)腫瘤。缺失獲得功能是這個(gè)案例的關(guān)鍵悖論:通常我們認(rèn)為缺失意味著丟失,但這里缺失把基因帶到了不該去的增強(qiáng)子旁。

更廣泛的結(jié)構(gòu)變異與 ecDNA 介導(dǎo)的劫持

HiChIP 和 H3K27ac HAPI 算法系統(tǒng)識(shí)別 34 種癌細(xì)胞系中的 enhancer hijacking,涉及 MYC、CCND1、ETV1、CRKL、ID4 等。

特別值得提及的是 ecDNA(extrachromosomal DNA,染色體外環(huán)狀 DNA)。這種環(huán)狀 DNA 上常攜帶致癌基因和它們的增強(qiáng)子,多條 ecDNA 之間還能彼此交換增強(qiáng)子(MYC-ERBB2 嵌合 ecDNA),形成一種調(diào)控元件的黑市(Wu 等 Nature 2019)。由于 ecDNA 沒(méi)有 CTCF 邊界,它的增強(qiáng)子-基因互作幾乎不受拓?fù)湎拗?可以創(chuàng)建超級(jí)活躍的 hub。

2. 超級(jí)增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)癌細(xì)胞身份

癌細(xì)胞和正常細(xì)胞一樣,身份由 SE 驅(qū)動(dòng)的核心調(diào)控環(huán)路(CRC)決定,但癌細(xì)胞往往篡奪了這個(gè)環(huán)路。

多發(fā)性骨髓瘤中 IgH-MYC 易位把 IgH 3′ SE 嫁接到 MYC 上,SE 還驅(qū)動(dòng) BCL-xL、IRF4 等的表達(dá)。BRD4/Mediator 在這些 SE 上密度極高,JQ1 能引發(fā) MYC 一過(guò)性的快速抑制(Lovén/Bradner Cell 2013),這是超級(jí)增強(qiáng)子概念的奠基性研究之一。

小細(xì)胞肺癌(SCLC)基于譜系定義 TF 分為 4 個(gè)亞型。SCLC-A 由 ASCL1 驅(qū)動(dòng),SCLC-N 由 NEUROD1 驅(qū)動(dòng),SCLC-P 由 POU2F3 驅(qū)動(dòng),SCLC-Y/I 由 YAP1 或炎癥型驅(qū)動(dòng)。每一亞型由各自 TF 的 SE 驅(qū)動(dòng),核心調(diào)控環(huán)路相互正反饋。MYC 高表達(dá)常驅(qū)動(dòng)從 SCLC-A 到 SCLC-N 的轉(zhuǎn)化。

DLBCL(彌漫大 B 細(xì)胞淋巴瘤)中的 BCL6 SE:GCB-DLBCL 中 BCL6 被強(qiáng) SE 驅(qū)動(dòng),BCL6 招募 SMRT/NCoR-HDAC3 抑制分化基因,把生發(fā)中心(GC)的暫停狀態(tài)變成永久狀態(tài)。EZH2 Y641 突變(22% GCB-DLBCL,7% FL)使 PRC2 的 H3K27me3 沉積獲得 Tyr/Phe switch 功能,把暫時(shí)性沉默升級(jí)為永久性沉默,鎖定 GC 狀態(tài)驅(qū)動(dòng)淋巴瘤化(Béguelin/Melnick Cancer Cell 2013)。

3. 啟動(dòng)子區(qū)甲基化異常

如前所述 CpG 島高甲基化沉默抑癌基因(MLH1、CDKN2A、BRCA1、MGMT、VHL 等)。CIMP(CpG island methylator phenotype)表型常關(guān)聯(lián) BRAF V600E、IDH1/2 突變(2-HG 抑制 TET 脫甲基酶);MAFG/BACH1/CHD8/DNMT3B 復(fù)合體把 BRAF 突變信號(hào)串聯(lián)到 MLH1 沉默。

相反,全基因組低甲基化常發(fā)生在重復(fù)元件、增強(qiáng)子、Polycomb 區(qū)域。腫瘤中可解鎖原本沉默的增強(qiáng)子,激活致癌基因表達(dá),并導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定。

4. 轉(zhuǎn)錄因子的異常激活與轉(zhuǎn)錄放大

MYCN 在神經(jīng)母細(xì)胞瘤:2p24 的 MYCN 擴(kuò)增是高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤的標(biāo)志。MYCN 與 SE 驅(qū)動(dòng)的 PHOX2B、HAND2、ISL1、GATA3、TBX2 形成 adrenergic-CRC,作為轉(zhuǎn)錄放大器全局放大基因表達(dá)。視黃酸治療能在另一個(gè) RA-CRC 中重塑 SE 景觀(guān),把 PHOX2B/GATA3 SE 解構(gòu)、激活 MEIS1/SOX4(Durbin 等,Nat Genet 2018)。

SOX2、OCT4 等多潛性 TF 在 SE 上自我反饋,癌干細(xì)胞依賴(lài)類(lèi)似機(jī)制。

5. 染色質(zhì)重塑因子突變

SWI/SNF(BAF)亞基突變累計(jì)存在于約 20% 的人類(lèi)腫瘤中。

SMARCB1 雙等位失活導(dǎo)致惡性橫紋肌樣瘤(MRT)、ATRT,這是典型的超低突變率單基因癌癥。SMARCA4(BRG1)失活導(dǎo)致小細(xì)胞肺癌、SCCOHT(卵巢小細(xì)胞癌的去分化型)、GIST;在 NSCLC 中,SMARCA4-mutant 腫瘤的增強(qiáng)子圖譜缺陷致免疫冷表型,免疫治療響應(yīng)差。ARID1A 突變常見(jiàn)于卵巢透明細(xì)胞癌(>50%)、子宮內(nèi)膜樣癌、胃癌、肝細(xì)胞癌;ARID1B 部分代償,雙失活致命,這是合成致死靶點(diǎn)。PBRM1 突變多見(jiàn)于腎透明細(xì)胞癌(40%)。BRD9(ncBAF)在滑膜肉瘤中,SS18-SSX1 融合保持 ncBAF 功能性。

機(jī)制層面 BAF 缺失減少增強(qiáng)子可及性、降低 H3K27ac、促進(jìn) Polycomb 沉默,導(dǎo)致譜系增強(qiáng)子塌陷,異常分化或重編程。

6. 表觀(guān)調(diào)控因子的異常突變

EZH2 Y641X(Y646X)GOF 突變(DLBCL 22%、FL 7%)減少單/二甲基化但增加三甲基化活性,導(dǎo)致 H3K27me3 蓄積。KMT2D(MLL4)共突變進(jìn)一步增強(qiáng) GC 狀態(tài)停滯,這是 tazemetostat 的分子靶點(diǎn)。

DOT1L 在 MLL 重排白血病中:MLL-AF4/AF9/ENL 等融合蛋白通過(guò) SEC 招募 DOT1L 至原本不甲基化的 MLL 靶基因(HOXA、MEIS1),異位 H3K79me2/3 觸發(fā)腫瘤維持轉(zhuǎn)錄。這些 H3K79me 標(biāo)記還定義了 MLL-r 白血病中一類(lèi)新型增強(qiáng)子(KEEs)。EPZ-5676(pinometostat)對(duì)此有針對(duì)性。

EP300/CBP 突變(DLBCL 約 30%,FL 約 40%,SCLC,膀胱癌)多為單等位 LOF 截短或 HAT 域 missense,導(dǎo)致 BCL6 靶基因和 H3K27ac 減少,免疫信號(hào)下降;HDAC3 抑制劑可作為合成致死。

KMT2D/MLL4 與 KMT2C/MLL3 突變(FL/DLBCL/膀胱、肺癌)使 H3K4me1 與協(xié)同 p300 招募下降,enhancer commissioning(增強(qiáng)子啟用)缺陷。

NSD1/NSD2/MMSET(H3K36me2)、KDM6A/UTX(H3K27me3 demethylase)也常突變。

7. eRNA 在腫瘤中的作用

BL 細(xì)胞中 IGH 區(qū) AL928768.3 eRNA 調(diào)節(jié) MYC 表達(dá)、影響化療敏感性。eRNA 如 PSA-eRNA、CCAT1-eRNA 在前列腺癌、結(jié)直腸癌中促進(jìn) AR/MYC 靶基因轉(zhuǎn)錄。總體上 eRNA 可作為活躍癌癥增強(qiáng)子的生物標(biāo)志,也是潛在的 ASO/siRNA 治療靶點(diǎn)。

8. 三維基因組重構(gòu)

癌癥不只改變了 DNA 序列,還改變了 DNA 的三維折疊方式,這是腫瘤研究中最迷人的領(lǐng)域之一。

IDH 突變膠質(zhì)瘤中,IDH1/2 GOF 突變催化產(chǎn)生 2-HG(2-羥基戊二酸),抑制 TET 和 KDM,導(dǎo)致 G-CIMP(高甲基化表型)。CTCF 結(jié)合位點(diǎn)的甲基化破壞 PDGFRA TAD 邊界,使其外部增強(qiáng)子激活 PDGFRA(Flavahan/Bernstein Nature 2016)。這是 TAD 邊界破壞致癌的經(jīng)典案例。

SDH-deficient GIST 中,SDH(琥珀酸脫氫酶)缺失導(dǎo)致琥珀酸蓄積,抑制 TET,造成全基因組高甲基化。FGF3/FGF4 與 ANO1 之間的 CTCF 絕緣子甲基化使 ANO1 SE 跨邊界激活 FGF4(Flavahan 等 Nature 2019)。該 PDX 模型對(duì) FGFR 加 KIT 聯(lián)合抑制劑敏感。

染色質(zhì)易位與 ecDNA 重排創(chuàng)造 neo-TAD/neo-loop。ecDNA 因缺少 CTCF 邊界形成超活躍 hub,MYC/EGFR 在其上以 SE 嫁接形式被多重激活。

9. 轉(zhuǎn)錄凝聚體在腫瘤中的作用

最后講一個(gè)最前沿的腫瘤機(jī)制:致癌融合蛋白形成異常凝聚體。

尤文肉瘤的 EWS-FLI1:t(11;22) 易位把 EWS 蛋白的 SYGQ-rich LCD(low complexity domain,低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域)與 FLI1 的 DNA 結(jié)合域融合。EWS-FLI1 在 GGAA 微衛(wèi)星(尤其 ≥10× GGAA 重復(fù))上以多體形式結(jié)合,LCD 介導(dǎo) LLPS 形成異常的轉(zhuǎn)錄凝聚體,招募 BAF、Mediator、Pol II,創(chuàng)建 de novo enhancer(如 NR0B1 啟動(dòng)子區(qū) 25× GGAA 重復(fù)處)。這些異常增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng) SOX2、IGF1R、ID2、NKX2-2 等致癌程序。最新研究還提示 EWS-FLI1 加速凝聚體老化為纖維狀(condensate aging),為 LLPS 解構(gòu)劑提供潛在靶點(diǎn)。

白血病的 NUP98 fusion:NUP98 N 端的 FG-repeats LCD 與 HOXA9/NSD1/KDM5A/PRRX1/PHF23/LNP1 等融合。FG repeats 與 DNA 結(jié)合域共同驅(qū)動(dòng) LLPS(同型與異型互作),在 HOX cluster 形成核小體凝聚體,招募 CRM1、MLL1/menin、CBP/p300,觸發(fā) HOX、MEIS1 等異常轉(zhuǎn)錄。凝聚體重組 3D 基因組,產(chǎn)生新染色質(zhì)環(huán)與 TAD 重排(Ahn 等 Nature 2021;Terlecki-Zaniewicz 等 Nat Struct Mol Biol 2021;Cell Rep 2023)。

其他融合驅(qū)動(dòng)的凝聚體包括 SS18-SSX(滑膜肉瘤,通過(guò) BAF 重塑)、BCR-ABL、MLL-fusions、TAF15/FUS-CHOP(粘液樣脂肪肉瘤)等,都涉及 IDR 介導(dǎo)的異常凝聚體。

這一系列發(fā)現(xiàn)的核心意義在于揭示了致癌融合蛋白的物理本質(zhì)。很多融合蛋白獲得功能不是因?yàn)樗鼈儷@得了新的酶活,而是因?yàn)?IDR 讓它們能形成新的凝聚體,把轉(zhuǎn)錄機(jī)器異位富集到不該激活的基因座。這從根本上改變了我們對(duì)癌基因的理解,癌癥某種程度上是生物物理學(xué)的疾病。

五、靶向增強(qiáng)子/啟動(dòng)子的腫瘤治療策略

理解了致病機(jī)制,治療策略就有了方向。靶向轉(zhuǎn)錄依賴(lài)性已成為腫瘤治療的新范式。

1. BET 抑制劑

JQ1 是首個(gè) BET BD1/BD2 雙競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑(Filippakopoulos 等 Nature 2010),直接坐進(jìn) BRD4 的乙酰賴(lài)氨酸識(shí)別口袋,使 BRD4 從染色質(zhì)上脫離。在 NUT 中線(xiàn)癌、MM、AML、Burkitt 中顯著抑制 MYC,但藥代動(dòng)力學(xué)差,主要是科研工具。

臨床推進(jìn)的化合物包括 OTX015 / birabresib(MK-8628),可口服,Phase Ib 在 AML/ALL 顯示活性(NCT01713582),多項(xiàng)實(shí)體瘤(GBM、NMC)在試驗(yàn)中。I-BET762(GSK525762)、I-BET151 也在進(jìn)展中。BD2-選擇性抑制劑 ABBV-744 減少血液系統(tǒng)毒性。BET PROTAC(dBET6、ARV-825 等)不只阻斷,而是降解 BRD4,效果更深。

主要瓶頸包括單藥效力有限、譜系性骨髓抑制、獲得性耐藥(LSD1/NuRD 重塑、WNT 反饋)。

2. CDK7 / CDK9 抑制劑

THZ1(Gray 實(shí)驗(yàn)室,2014)是共價(jià) CDK7 抑制劑,靶向 Cys312 遠(yuǎn)端半胱氨酸。它優(yōu)先殺傷超級(jí)增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)的腫瘤,包括 T-ALL(RUNX1)、MYCN-amp 神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Cell 2014, Chipumuro 等)、TNBC、SCLC、ATC、卵巢癌。這類(lèi)腫瘤對(duì) SE 程序高度依賴(lài),稍微一抑制就崩潰。衍生物已進(jìn)入臨床:SY-1365(mevociclib)、SY-5609(選擇性,口服)、CT7001(samuraciclib)。

CDK9/P-TEFb 抑制劑包括 flavopiridol/alvocidib、AZD4573;非選擇性 CDK 抑制劑 dinaciclib(CDK1/2/5/9)在 CLL/MM 顯示活性;選擇性 CDK9 PROTAC 正在開(kāi)發(fā)。

CDK12/13 抑制劑(THZ531)破壞 DNA 修復(fù)基因轉(zhuǎn)錄,與 PARP 抑制劑協(xié)同。

3. EP300/CBP 抑制劑

A-485 是 CBP/p300 HAT 域催化抑制劑,降低 H3K27ac、抑制 MYC/CCND1、AR 靶基因表達(dá),在 AML、MM、NHL、CRPC 臨床前有效。CBP30、GNE-049、CCS1477(inobrodib)是 bromodomain 抑制劑,CCS1477 已在 CRPC、AML I 期臨床。

4. EZH2 抑制劑

Tazemetostat(Tazverik / EPZ-6438)是 SAM 競(jìng)爭(zhēng)性 EZH2 抑制劑,2020 年 FDA 加速批準(zhǔn)用于 INI1 陰性上皮樣肉瘤、EZH2-mutant R/R FL,在 SMARCB1 缺失 MRT、DLBCL 也有活性。注意 2025 年因 SYMPHONY 試驗(yàn)(R2 ± tazemetostat)出現(xiàn)繼發(fā)性血液惡性腫瘤的安全信號(hào),Ipsen 自愿撤回 FDA 適應(yīng)癥,治療組停藥繼續(xù)隨訪(fǎng)。

Valemetostat 是 EZH1/2 雙抑制劑,在 ATLL、外周 T 淋巴瘤獲得日本批準(zhǔn)。第二代 EZH2 PROTAC 正在開(kāi)發(fā)。

5. DOT1L 抑制劑

EPZ-5676 / Pinometostat 是 SAM 競(jìng)爭(zhēng)性,在 MLL-r AML/ALL 臨床數(shù)據(jù)有限但有活性,為聯(lián)合治療策略奠定基礎(chǔ)(與 menin 抑制劑 revumenib/SNDX-5613 協(xié)同)。

Menin-MLL 抑制劑如 revumenib 在 NPM1-mut 與 KMT2A-r AML 中已顯示重要療效,這是近年來(lái)白血病治療的重要進(jìn)展。

6. Mediator 與其他靶點(diǎn)

CDK8/CDK19(Mediator kinase)抑制劑如 senexin B、SNX631、BCD-115/RVU120 等(NCT04021368、NCT05052255)在 AML/CMML、TNBC、HER2+ 乳腺癌、卵巢透明細(xì)胞癌、CRC 中評(píng)估,機(jī)制是抑制轉(zhuǎn)錄重編程、克服靶向治療耐藥。

MED12 突變(子宮平滑肌瘤、甲狀腺癌)目前暫無(wú)直接小分子。

Cohesin/CTCF 拓?fù)浒邢蛏刑幱诟拍铍A段,但 STAG2 失活的合成致死(STAG1 依賴(lài))正在開(kāi)發(fā)肽抑制劑。

針對(duì)凝聚體的策略目前以 1,6-hexanediol 作為工具性證據(jù),臨床前研究探討 IDR/condensate 形成性藥物;某些 BET 抑制劑、DRB 類(lèi)與 LLPS 解構(gòu)相關(guān)。

注意事項(xiàng)與開(kāi)放問(wèn)題

讀完整篇文章應(yīng)該已經(jīng)能從某些角度回答開(kāi)篇的四個(gè)謎題。但科學(xué)研究永遠(yuǎn)在進(jìn)行中,以下是幾個(gè)值得警惕的開(kāi)放問(wèn)題。

超級(jí)增強(qiáng)子是定量定義而非生化劃界。ROSE 排序的拐點(diǎn)是經(jīng)驗(yàn)性的,SE 與典型增強(qiáng)子在生化機(jī)制上多為程度差異;不同 ChIP 標(biāo)記會(huì)得出不同 SE 列表。

接觸與通信的爭(zhēng)議未平息。活細(xì)胞成像挑戰(zhàn)了 E-P 必須緊密接觸才能轉(zhuǎn)錄的傳統(tǒng)觀(guān)念,凝聚體模型尚需更多內(nèi)源性證據(jù);1,6-hexanediol 的特異性受到質(zhì)疑。

MLL3/4 與 H3K4me1 的因果關(guān)系。近期 CRISPR 催化死亡(catalytic-dead)實(shí)驗(yàn)提示 H3K4me1 的存在并非增強(qiáng)子激活的必要充分條件,MLL3/4 更多通過(guò)支架功能起作用。修飾標(biāo)簽往往是結(jié)果而非原因。

eRNA 功能爭(zhēng)議。部分研究認(rèn)為 eRNA 僅是轉(zhuǎn)錄副產(chǎn)物,其特異調(diào)控功能取決于具體基因座、細(xì)胞類(lèi)型與 eRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu),仍需更多定量、單分子數(shù)據(jù)。

泛 BET 抑制劑的脫靶與耐藥。JQ1/OTX015 的臨床效益單藥有限;短半衰期、骨髓毒性、腸道毒性、脫靶 BRD2/3 都是問(wèn)題;BET 阻斷后細(xì)胞通過(guò) LSD1/NuRD 的 SE 重塑產(chǎn)生耐藥。

Tazemetostat 撤市。2025 年 4 月 Ipsen 因 SYMPHONY 數(shù)據(jù)(繼發(fā)血液惡性)自愿撤回 FDA FL/ES 適應(yīng)癥,臨床應(yīng)用受限;新一代 EZH 抑制劑(EZH1/2 雙抑制劑、PROTAC)正在替代。

CDK 抑制劑(尤其 CDK7/9)的治療窗口問(wèn)題。由于 RNA Pol II CTD 磷酸化的全局性,選擇性窗口取決于細(xì)胞對(duì) SE-驅(qū)動(dòng)基因的依賴(lài),腫瘤特異性需精準(zhǔn)患者篩選。

凝聚體模型推斷的臨床轉(zhuǎn)化。很多關(guān)于 EWS-FLI1、NUP98 凝聚體功能的結(jié)論建立在過(guò)表達(dá)系統(tǒng)(如 mESC、HEK293)中,內(nèi)源水平、原位組織水平的驗(yàn)證仍在推進(jìn)。

3D 基因組學(xué)的解釋多為統(tǒng)計(jì)性。Hi-C/HiChIP 是群體測(cè)量,單細(xì)胞 Hi-C 數(shù)據(jù)稀疏,提到的環(huán)和 hub 通常是統(tǒng)計(jì)性平均;接觸頻率與轉(zhuǎn)錄功能的因果鏈需 CRISPRi/dCas9 與 Region Capture Micro-C 等高分辨率工具進(jìn)一步驗(yàn)證。

Enhancer hijacking 判定標(biāo)準(zhǔn)不一。HAPI、Neoloop、PANGEA、CESAM 等算法各有偏倚,候選基因優(yōu)先級(jí)需要結(jié)合 H3K27ac HiChIP、表達(dá)相關(guān)性、CRISPRi 功能驗(yàn)證三重證據(jù)。

前瞻性陳述的臨床現(xiàn)實(shí)。本文提到的部分前瞻性?xún)?nèi)容(某些 PROTAC、condensate-modifying drugs)目前仍處于臨床前或早期探索階段,臨床轉(zhuǎn)化效果未有定論。