分子馬達(dá)，最新Nature Nanotechnology！

成功構(gòu)建人工蛋白“步行器”：可沿DNA軌道定向行走

自然界的蛋白質(zhì)馬達(dá)一直是生命科學(xué)中令人著迷的精密機(jī)器，它們能夠?qū)⒒瘜W(xué)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械功，以驚人的效率和精確性完成生命活動(dòng)。然而，設(shè)計(jì)并實(shí)現(xiàn)一個(gè)能夠定向移動(dòng)的人工蛋白馬達(dá)，一直是合成生物學(xué)和納米技術(shù)領(lǐng)域長(zhǎng)期未能攻克的核心挑戰(zhàn)。 盡管近年來(lái)在DNA和小分子馬達(dá)方面取得了進(jìn)展，但借助蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)來(lái)構(gòu)建具有持續(xù)定向運(yùn)動(dòng)能力的人工蛋白馬達(dá)仍然困難重重，難點(diǎn)在于如何將具有不同功能的柔性蛋白組件耦合并協(xié)調(diào)起來(lái)，使其在結(jié)合表面和定向運(yùn)動(dòng)的同時(shí)實(shí)現(xiàn)能量轉(zhuǎn)換。

近日，?澳大利亞新南威爾士大學(xué)Paul M. G. Curmi教授和瑞典隆德大學(xué)Heiner Linke教授合作，報(bào)告了他們成功構(gòu)建的一種名為“風(fēng)滾草”（簡(jiǎn)稱TW）的人工蛋白步行器。 該蛋白能夠在外部配體控制下，沿DNA軌道進(jìn)行方向性的16納米步進(jìn)運(yùn)動(dòng)。通過(guò)模塊化設(shè)計(jì)策略，研究團(tuán)隊(duì)將多個(gè)本身不具備馬達(dá)功能的已知蛋白元件組合在一起，使整個(gè)復(fù)合物表現(xiàn)出超越各個(gè)組件簡(jiǎn)單相加的涌現(xiàn)功能。結(jié)合單分子熒光技術(shù)與可編程微流控裝置，該團(tuán)隊(duì)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)TW步行方向和速度的精確控制，還通過(guò)動(dòng)力學(xué)模擬驗(yàn)證了其作為化學(xué)能驅(qū)動(dòng)布朗棘輪的運(yùn)行機(jī)制——TW的每一步依賴于熱驅(qū)動(dòng)的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，而配體的順序交換提供自由能來(lái)打破對(duì)稱性，從而實(shí)現(xiàn)凈定向運(yùn)動(dòng)。相關(guān)論文以“Clocked stepping of an artificial protein walker along a DNA track”為題，發(fā)表在Nature Nanotechnology上。

該人工蛋白步行器的核心設(shè)計(jì)思路包含三個(gè)關(guān)鍵概念（圖1）。首先，TW擁有三條“腿”，每條腿均由不同的阻遏蛋白構(gòu)成，它們只有在各自對(duì)應(yīng)的配體分子存在時(shí)才能特異性結(jié)合DNA軌道上的特定序列。這三個(gè)足部分別是識(shí)別色氨酸的TrpR、識(shí)別鈷離子的DtxR以及識(shí)別S-腺苷甲硫氨酸的MetJ。這些足部通過(guò)柔性連接區(qū)與α螺旋卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的“腿部”相連，最終匯聚于一個(gè)中心的SpyTag/SpyCatcher連接樞紐，形成一個(gè)三足結(jié)構(gòu)（圖1a）。其次，為了確保單向運(yùn)動(dòng)，DNA軌道上按照“trpR-dtxR-metJ”的特定順序排列了這些蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，并且通過(guò)設(shè)計(jì)位點(diǎn)間距，保證TW在任何時(shí)刻只有相鄰的兩個(gè)足能夠同時(shí)結(jié)合到軌道上，而無(wú)法同時(shí)接觸非相鄰位點(diǎn)（圖1b）。最后，TW的運(yùn)動(dòng)由外部配體溶液的循環(huán)切換來(lái)控制。通過(guò)按順序?qū)W浸泡在（色氨酸+鈷離子）、（鈷離子+SAM）和（SAM+色氨酸）三對(duì)配體溶液中，步行器會(huì)依次以“TrpR-DtxR”、“DtxR-MetJ”和“MetJ-TrpR”三種雙足結(jié)合狀態(tài)沿軌道前進(jìn)，從而完成一個(gè)完整的步進(jìn)周期（圖1c）。

圖1 | TW人工時(shí)鐘控步行蛋白概念。 a，我們從兩個(gè)同源二聚體蛋白TW1和TW2構(gòu)建了TW。TW1包含DtxR阻遏蛋白、一個(gè)geminin螺旋和SpyCatcher蛋白。TW2包含TrpR阻遏蛋白、一個(gè)geminin螺旋、SpyTag、另一個(gè)geminin螺旋和MetJ阻遏蛋白。通過(guò)SpyTag/SpyCatcher系統(tǒng)共價(jià)組裝TW1和TW2。b，為實(shí)現(xiàn)單向運(yùn)動(dòng)，我們使用了包含TW三個(gè)足部各自同源結(jié)合位點(diǎn)（以對(duì)接狀態(tài)顯示）的有序序列的DNA軌道：trpR-dtxR-metJ，該序列可無(wú)限重復(fù)，并排列使TW保持在軌道的同一面。c，通過(guò)時(shí)間依賴性地將TW浸泡在配體溶液中來(lái)控制定向運(yùn)動(dòng)。在色氨酸存在下（上圖；Trp，藍(lán)色三角形），TW通過(guò)TrpR足（青色）結(jié)合。加入Co2?（粉紅色方塊，自上而下第二圖）后，DtxR足（品紅色）也結(jié)合到與TrpR足相鄰的軌道上。當(dāng)Trp濃度降低時(shí)（自上而下第三圖），TrpR足從軌道上釋放。加入S-腺苷甲硫氨酸（自上而下第四圖；SAM；橙色圓圈）后，MetJ足（棕色）結(jié)合到與DtxR足相鄰的位置。當(dāng)Co2?濃度降低時(shí)（自下而上第二圖），DtxR足釋放。最后，重新加入Trp后，TrpR足結(jié)合到與MetJ足相鄰的位置（底圖）。注意，TW和軌道的設(shè)計(jì)使得每個(gè)結(jié)合足只能到達(dá)一個(gè)位點(diǎn)（例如，底圖中的近端而非遠(yuǎn)端的trpR位點(diǎn)）。

研究人員對(duì)TW的組裝和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了全面表征。他們分別表達(dá)并純化了TW的兩個(gè)組分TW1和TW2，通過(guò)SpyTag/SpyCatcher系統(tǒng)共價(jià)連接形成完整的TW蛋白，并利用尺寸排阻色譜和質(zhì)譜光度量法確認(rèn)了其準(zhǔn)確的分子量（圖2a,b）。通過(guò)小角X射線散射分析，他們發(fā)現(xiàn)TW在溶液中呈現(xiàn)柔性構(gòu)象，最佳擬合結(jié)果表明其存在兩種主要構(gòu)象：一種為L(zhǎng)形，另一種為伸展?fàn)顟B(tài)（圖2c）。原子力顯微鏡圖像清晰地顯示，在色氨酸存在下，8個(gè)TW蛋白能夠均勻地結(jié)合在含有8個(gè)重復(fù)結(jié)合位點(diǎn)的線性DNA軌道上，且結(jié)合位置與插入片段的預(yù)期位置完全一致，通過(guò)測(cè)量?jī)蓚?cè)側(cè)翼DNA的輪廓長(zhǎng)度得到了確認(rèn)，驗(yàn)證了軌道設(shè)計(jì)的有效性（圖2d）。

圖2 | TW的組裝與表征。 a，SDS-PAGE顯示共價(jià)TW組裝及SEC純化后的TW（TW尺寸排阻純化后）。所有后續(xù)實(shí)驗(yàn)均使用TW尺寸排阻純化后的蛋白。b，純化的TW1、TW2和TW的質(zhì)譜光度量表征。插圖：每種蛋白物種的理論和觀測(cè)分子量（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=4）。c，TW的SEC-SAXS分析。右上圖為SAXS強(qiáng)度作為q（以??1為單位的動(dòng)量傳遞）的函數(shù)。插圖：數(shù)據(jù)的Guinier圖；使用Multi-FoXS程序?qū)?shù)據(jù)擬合到構(gòu)象集合。最佳擬合（右上圖，紅線）由χ2確定，使用兩種構(gòu)象體，一種為L(zhǎng)形（模型1，左上）和一種為伸展?fàn)睿Ｐ?，左下），權(quán)重分別為0.725和0.275。誤差加權(quán)殘差圖（右下圖）顯示模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間沒(méi)有顯著的系統(tǒng)偏差。d，AFM圖像顯示在Trp存在下，八個(gè)TW結(jié)合到插入側(cè)翼序列之間的八個(gè)重復(fù)的metJ-trpR-dtxR軌道上。

為了驗(yàn)證TW各足部的結(jié)合特異性，研究團(tuán)隊(duì)利用表面等離子體共振技術(shù)進(jìn)行了細(xì)致的親和力測(cè)定（圖3a）。結(jié)果表明，在沒(méi)有配體的情況下，TW與DNA的結(jié)合極弱；而只有在添加了對(duì)應(yīng)配體后，相應(yīng)的足部才會(huì)高特異性地結(jié)合其目標(biāo)DNA序列，表觀解離常數(shù)Kd在8-27 nM范圍內(nèi)（圖3b），并且每個(gè)TW蛋白僅與一個(gè)DNA分子形成1:1的復(fù)合物（圖3c）。重要的是，TW在雙位點(diǎn)DNA上只有在兩種對(duì)應(yīng)配體同時(shí)存在時(shí)才能形成穩(wěn)定的雙足結(jié)合狀態(tài)。動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)揭示，單個(gè)足部在去除配體后的解離半衰期不到4秒，而在雙配體存在下的雙足結(jié)合狀態(tài)半衰期則長(zhǎng)達(dá)至少30-50秒（圖3d）。這種巨大的時(shí)間尺度差異為通過(guò)順序切換配體來(lái)實(shí)現(xiàn)可控步進(jìn)提供了關(guān)鍵的動(dòng)力學(xué)窗口。

圖3 | 優(yōu)化TW：DNA軌道相互作用。 a，SPR傳感圖面板，將5nM、10nM、20nM、40nM和80nM的TW滴定到含有單個(gè)同源位點(diǎn)（metJ、dtxR和trpR位點(diǎn)）的DNA寡核苷酸上，在存在或不存在控制配體的情況下，顯示TW的每個(gè)足部（在配體存在下）與其同源DNA的預(yù)期結(jié)合，且非特異性結(jié)合極低。b，代表性結(jié)合曲線，將平均穩(wěn)態(tài)SPR響應(yīng)擬合到Hill方程。曲線顯示TW（圓圈）和單個(gè)阻遏蛋白二聚體（三角形）在控制配體存在下與含有單個(gè)同源位點(diǎn)（棕色，metJ；品紅色，dtxR；青色，trpR）的單一位點(diǎn)軌道的結(jié)合。c，質(zhì)譜光量數(shù)據(jù)比較TW與含有metJ和trpR位點(diǎn)的雙鏈DNA復(fù)合物在無(wú)配體（灰色）和存在SAM和Trp（橙色）時(shí)的估計(jì)分子質(zhì)量分布。無(wú)配體時(shí)觀測(cè)到的128±2 kDa（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）和存在SAM與Trp時(shí)觀測(cè)到的183±3 kDa的分子質(zhì)量分別與理論質(zhì)量133 kDa和183 kDa高度一致。d，不同TW：DNA復(fù)合物的表觀半衰期，由SPR實(shí)驗(yàn)擬合的k_off值計(jì)算得出，TW在配體存在（實(shí)心圓）或去除后（空心圓）與DNA結(jié)合。通過(guò)加入過(guò)量游離競(jìng)爭(zhēng)性特異性DNA在配體存在或不存在的情況下觸發(fā)解離。控制配體對(duì)應(yīng)各自的DNA軌道，如圖所示。圓圈代表重復(fù)實(shí)驗(yàn)的各個(gè)值。

單分子FRET實(shí)驗(yàn)是驗(yàn)證TW定向步進(jìn)的核心（圖4a-c）。研究人員設(shè)計(jì)了一條包含四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的DNA軌道，并在軌道兩端的trpR位點(diǎn)上標(biāo)記了不同的FRET受體，同時(shí)將熒光供體標(biāo)記在TW的TrpR足部。這樣一來(lái)，根據(jù)TrpR足結(jié)合在軌道底端、中間還是頂端，系統(tǒng)會(huì)分別發(fā)出不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)。實(shí)驗(yàn)一結(jié)果顯示，隨著微流控設(shè)備中配體溶液的周期性切換（圖4d,e），數(shù)百個(gè)單個(gè)TW分子的熒光信號(hào)呈現(xiàn)出同步的、反相位的交替變化（圖4f-i），清晰地表明TrpR足部按照配體指令反復(fù)結(jié)合和解離，證明TW確實(shí)在沿著軌道行走（圖4g-i）。

圖4 | 單分子FRET實(shí)驗(yàn)1：TW在配體變化響應(yīng)下沿DNA軌道步進(jìn)。 TW行走實(shí)驗(yàn)在一個(gè)四聯(lián)位點(diǎn)（從底部到頂部為trpR-dtxR-metJ-trpR）DNA軌道上進(jìn)行，該軌道通過(guò)生物素-鏈霉親和素連接固定在生物素化PLL-g-PEG鈍化表面。底部和頂部的trpR位點(diǎn)分別用不同的FRET受體（ATTO565和ATTO647N）標(biāo)記。TrpR足部用FRET供體Alexa Fluor 488（綠色發(fā)射體）標(biāo)記。a-c，我們預(yù)期在配體對(duì)存在下形成的TW：DNA復(fù)合物：a中為Trp+Co2?，b中為SAM+Co2?，c中為SAM+Trp。這三個(gè)復(fù)合物中的每一個(gè)在488nm激光激發(fā)時(shí)都設(shè)計(jì)為產(chǎn)生不同的熒光信號(hào)：當(dāng)TrpR足結(jié)合到底部trpR位點(diǎn)時(shí)FRET至ATTO565（發(fā)射峰590nm）（a），自由TrpR足的Alexa Fluor488發(fā)射（發(fā)射峰525nm）（b），以及當(dāng)TrpR足結(jié)合到頂部trpR位點(diǎn)時(shí)FRET至ATTO647N（發(fā)射峰664nm）（c）。使用543nm發(fā)射分光進(jìn)行雙色成像，同時(shí)記錄Alexa Fluor488發(fā)射（綠色顯示）和ATTO565加ATTO647N發(fā)射（品紅色顯示）。d，控制溶液及其隨時(shí)間交換的方式：Trp+Co2?（TC）、SAM+Co2?（SC）和Trp+SAM（TS）。e，d中控制溶液對(duì)應(yīng)的TW在DNA軌道上預(yù)期位置的示意圖。f，e中TW：DNA復(fù)合物預(yù)期的熒光信號(hào)。g，來(lái)自單個(gè)視野的所有322個(gè)檢測(cè)到的共定位單分子的Kymograph，按最后一次檢測(cè)到的熒光時(shí)間排序。h，歸一化的單分子軌跡示例。i，kymograph g中所有單分子軌跡的總和。

在第二個(gè)單分子實(shí)驗(yàn)中，研究人員將兩個(gè)FRET受體的發(fā)射光分別成像到不同通道，以明確區(qū)分TW是結(jié)合在軌道的頂端還是底端（圖5a-c）。結(jié)果再次顯示，熒光信號(hào)與配體切換完美同步（圖5d-f），TW能夠在軌道兩端之間往復(fù)運(yùn)動(dòng)（圖5g-i）。通過(guò)分析大量單分子軌跡，他們發(fā)現(xiàn)TW的TrpR足部約有65%±8%的時(shí)間正確結(jié)合到預(yù)期的相鄰trpR位點(diǎn)，而約有35%±6%的時(shí)間會(huì)“超步”——即跳過(guò)中間位點(diǎn)直接結(jié)合到更遠(yuǎn)的同一位點(diǎn)（無(wú)論是向前還是向后）。這種隨機(jī)過(guò)步行為在天然生物馬達(dá)如肌球蛋白和驅(qū)動(dòng)蛋白中同樣存在，是隨機(jī)熱力學(xué)所預(yù)測(cè)的分子馬達(dá)基本特征之一。

基于實(shí)驗(yàn)測(cè)得的結(jié)合與解離速率以及觀察到的35%過(guò)步概率，研究人員建立了粗粒化動(dòng)力學(xué)模型。模型模擬結(jié)果很好地重現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)中的單分子熒光軌跡，并預(yù)測(cè)在無(wú)限長(zhǎng)的DNA軌道上，TW每完成一個(gè)完整的三步配體循環(huán)（約21秒）可前進(jìn)約0.4個(gè)軌道周期（一個(gè)軌道周期為49納米），對(duì)應(yīng)速度約為0.93納米/秒。在發(fā)生光漂白或TW完全解離前，單個(gè)TW平均可連續(xù)行走約3至6步，覆蓋約50至100納米的距離。

圖5 | 單分子FRET實(shí)驗(yàn)2：TW訪問(wèn)DNA軌道的兩端。 a-c，使用與圖4相同的四聯(lián)位點(diǎn)DNA軌道和熒光標(biāo)記，但使用633nm發(fā)射分光進(jìn)行雙色成像，同時(shí)記錄ATTO565發(fā)射和ATTO647N發(fā)射。通過(guò)這種方式，我們可以區(qū)分TW TrpR足是結(jié)合到頂部trpR位點(diǎn)（a，F(xiàn)RET發(fā)射峰664nm，品紅色顯示）還是底部trpR位點(diǎn)（c，F(xiàn)RET發(fā)射峰590nm，青色顯示），而中心位置具有自由TrpR足（b）預(yù)期記錄為暗色。d，控制溶液及其隨時(shí)間交換的方式：Trp+Co2?（TC）、SAM+Co2?（SC）和Trp+SAM（TS）。e，這些時(shí)間點(diǎn)TW在DNA軌道上預(yù)期位置的示意圖。f，d中狀態(tài)對(duì)應(yīng)的TW：DNA復(fù)合物預(yù)期的熒光信號(hào)。g，來(lái)自四個(gè)視野的所有236個(gè)檢測(cè)到的共定位單分子的Kymograph，按最后一次檢測(cè)到的熒光時(shí)間排序。h，歸一化的單分子軌跡示例。i，kymograph g中所有單分子軌跡的總和。

這項(xiàng)研究成果不僅首次實(shí)現(xiàn)了由非馬達(dá)蛋白模塊組裝而成的人工定向蛋白步行器，更為開(kāi)發(fā)完全自主運(yùn)行的人工蛋白馬達(dá)奠定了關(guān)鍵基礎(chǔ)。 該模塊化設(shè)計(jì)策略繞過(guò)了從頭設(shè)計(jì)具有復(fù)雜動(dòng)態(tài)特性的蛋白的固有難題，證明了通過(guò)組合和整合已知功能域來(lái)獲得涌現(xiàn)特性的可行性。這一人工步行器也為研究納米尺度馬達(dá)的能量效率、精確性與速度之間的物理權(quán)衡提供了一個(gè)理想的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。隨著DNA軌道剛性的進(jìn)一步優(yōu)化和微流控切換時(shí)間的縮短，該人工蛋白馬達(dá)的性能有望進(jìn)一步接近天然蛋白馬達(dá)，為未來(lái)構(gòu)建復(fù)雜、動(dòng)態(tài)的蛋白基納米機(jī)器開(kāi)辟了全新道路。