R2逆轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)大片段基因整合：研究進(jìn)展與應(yīng)用展望

原文發(fā)表于《科技導(dǎo)報(bào)》202 6年第11期《R2逆轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的大片段基因整合技術(shù)新進(jìn)展》

基因編輯是通過特定技術(shù)手段，對(duì)生物體基因組的特定目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)修飾，進(jìn)而調(diào)控其遺傳信息與表型特征的技術(shù)過程。其中，大片段基因整合技術(shù)可在生物體基因組中實(shí)現(xiàn)大片段外源DNA的精準(zhǔn)插入或替換，為重大疾病的創(chuàng)新治療方案開發(fā)提供了核心技術(shù)支撐。《科技導(dǎo)報(bào)》邀請(qǐng)中國科學(xué)院動(dòng)物研究所器官再生與智造全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中國科學(xué)院大學(xué)、北京干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究院李偉研究員團(tuán)隊(duì)撰寫文章，從該技術(shù)的歷史起源切入，系統(tǒng)梳理了其發(fā)展脈絡(luò)，并剖析了當(dāng)前大片段基因整合技術(shù)存在的技術(shù)瓶頸。進(jìn)一步介紹了R2逆轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)引發(fā)逆轉(zhuǎn)錄的整合機(jī)制，綜述了研究進(jìn)展并總結(jié)了R2逆轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的大片段整合工具的技術(shù)突破以及應(yīng)用前景，為其在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論啟發(fā)與實(shí)踐參考。

基因編輯技術(shù)是一類通過精準(zhǔn)識(shí)別和修飾生物體基因組外源脫氧核糖核酸（DNA）序列，實(shí)現(xiàn)遺傳信息與表型特征改變的生物技術(shù)。大片段基因整合技術(shù)是基因編輯領(lǐng)域的重要分支，可以實(shí)現(xiàn)外源大片段DNA在基因組特定位點(diǎn)的穩(wěn)定整合，為疾病診療提供創(chuàng)新解決方案。

隨著生命科學(xué)研究的深入及醫(yī)學(xué)應(yīng)用需求的升級(jí)，大片段整合技術(shù)歷經(jīng)從依賴同源重組（HR）的傳統(tǒng)模式向非DNA雙鏈斷裂（DSB）依賴的新型整合路徑的轉(zhuǎn)變，供體形式也從單一的DNA供體拓展至更適配醫(yī)學(xué)應(yīng)用場(chǎng)景的核糖核酸（RNA）供體。這一技術(shù)演進(jìn)不僅突破了早期HR技術(shù)在整合效率上的局限，更推動(dòng)了基因治療從理論探索向臨床轉(zhuǎn)化的跨越。

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大片段整合技術(shù)的歷史與發(fā)展

大片段整合技術(shù)是一種能夠?qū)⒋笃蜠NA精準(zhǔn)整合至基因組特定位置的基因編輯技術(shù)。大片段整合技術(shù)的起源可追溯至HR的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用。1982年，F(xiàn)olger等在哺乳動(dòng)物細(xì)胞顯微注射外源DNA體系中，證實(shí)導(dǎo)入的質(zhì)粒分子間可自發(fā)發(fā)生HR。1985年，Smthies等利用電穿孔法實(shí)現(xiàn)了外源DNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)源基因座（人β?珠蛋白位點(diǎn)）的定點(diǎn)整合。隨后，Wong等從分子層面闡明同源重組介導(dǎo)外源基因定點(diǎn)整合的作用機(jī)制。20世紀(jì)90年代，Rouet等與Sargent等借助其特異性切割DNA的特性引發(fā)DSB，進(jìn)而激活細(xì)胞修復(fù)機(jī)制，顯著提升HR效率。

1996年，基因編輯領(lǐng)域迎來新突破。科學(xué)家利用鋅指蛋白對(duì)DNA的特異性識(shí)別能力，成功構(gòu)建出鋅指核酸酶（ZFNs）。這一可編程核酸內(nèi)切酶的誕生，打破了傳統(tǒng)技術(shù)在靶向切割位點(diǎn)上的限制，極大地拓展了HR技術(shù)的應(yīng)用范圍。此后，研究人員借鑒類似設(shè)計(jì)思路，開發(fā)出轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALENs）。TALENs在設(shè)計(jì)上更具靈活性，為基因整合的精準(zhǔn)性提供了更有力的選擇。

規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白（CRISPR/Cas）系統(tǒng)的問世，標(biāo)志著HR介導(dǎo)的大片段精準(zhǔn)整合技術(shù)迎來又一次革命性突破。2012年，Jinek等在體外解析了釀膿鏈球菌來源的CRISPR/Cas9系統(tǒng)（SpCas9）的功能，將tracrRNA?crRNA雙RNA結(jié)構(gòu)簡化為單引導(dǎo)RNA（sgRNA），并證實(shí)該系統(tǒng)可通過改變其中20 nt的間隔序列實(shí)現(xiàn)可編程基因編輯。隨后，Cong等與Mali等分別成功將其應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞編輯。該體系可在靶標(biāo)位點(diǎn)高效產(chǎn)生DSB，極大提高了HR的效率，降低了操作難度，革新了大片段精準(zhǔn)整合領(lǐng)域（圖1（a））。

為改善傳統(tǒng)技術(shù)依賴DSB可能帶來的弊端，研究逐步聚焦于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的功能改造。該系統(tǒng)的DNA切割功能由HNH和RuvC雙結(jié)構(gòu)域協(xié)同完成，通過對(duì)H840A、D10A等關(guān)鍵活性位點(diǎn)的定點(diǎn)突變，可獲得2種重要功能變體。將這2種功能變體與效應(yīng)蛋白融合，能夠開發(fā)新型基因編輯工具，從而繞過DSB修復(fù)過程，顯著降低Indel頻率。Anzalone等成功開發(fā)了先導(dǎo)編輯技術(shù)（PE）。該技術(shù)能夠高效實(shí)現(xiàn)靶向位點(diǎn)的片段插入、缺失及堿基替換，尤其在100 bp以內(nèi)的小片段整合中表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。Anzalone等和Pandey等進(jìn)一步將PE系統(tǒng)與位點(diǎn)特異性絲氨酸整合酶Bxb1偶聯(lián)，研發(fā)出PASSIGE技術(shù)。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了超過10 kb DNA片段的精準(zhǔn)整合，并通過定向進(jìn)化策略顯著提升了整合效率（圖1（b））。Yarnall等采用類似策略獨(dú)立開發(fā)的PASTE技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了最高36 kb DNA的大片段基因組整合，為基因治療領(lǐng)域的大片段遞送提供了重要技術(shù)支撐。

在先導(dǎo)編輯系統(tǒng)中，研究人員利用了RT以RNA模板合成DNA的特性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因組序列的整合，這為擺脫傳統(tǒng)編輯技術(shù)對(duì)DNA供體的依賴開辟了全新思路。因此，研究者將目光轉(zhuǎn)向自然界中天然存在的逆轉(zhuǎn)座子元件。其中，R2逆轉(zhuǎn)座子是近年來開發(fā)新型大片段整合技術(shù)的研究焦點(diǎn)（圖1（c））。

圖1 大片段整合技術(shù)實(shí)現(xiàn)路徑

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R2逆轉(zhuǎn)座子的開發(fā)與應(yīng)用

R2逆轉(zhuǎn)座子是一類可特異性整合到核糖體DNA（rDNA）中的可移動(dòng)元件，最早由Dawid等與Roiha等在果蠅的28S rDNA基因位點(diǎn)中鑒定。

R2逆轉(zhuǎn)座子由蛋白組分與RNA組分2部分組成。其中蛋白組分是一個(gè)多功能R2蛋白，而RNA組分則是一條可翻譯出R2蛋白的mRNA，其除了蛋白表達(dá)框，還包含有兩端的非編碼區(qū)（UTR）。R2逆轉(zhuǎn)座子在進(jìn)化譜系中可進(jìn)一步劃分為R2?A、R2?B、R2?C、R2?D 4個(gè)分支，各分支之間的核心差異主要體現(xiàn)在N端ZF基序的數(shù)量上（圖2）。

圖2 R2逆轉(zhuǎn)座子的組成

R2逆轉(zhuǎn)座子特異性整合到rDNA的特性避免了隨機(jī)整合帶來的風(fēng)險(xiǎn)，因此十分有利于開發(fā)成為可全RNA遞送的靶向基因整合工具。

2.1 R2逆轉(zhuǎn)座子的整合機(jī)制

在逆轉(zhuǎn)座過程中，R2蛋白的多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域協(xié)同發(fā)揮功能，并與R2 RNA形成復(fù)合物，通過有序的多步反應(yīng)實(shí)現(xiàn)自身序列的精準(zhǔn)整合。

整合開始前，R2蛋白的NTE?1結(jié)構(gòu)域參與識(shí)別并結(jié)合R2 RNA的3' UTR，從而形成核糖核蛋白復(fù)合物。隨后該復(fù)合物特異性識(shí)別rDNA插入位點(diǎn)附近的2段保守DNA基序。第一段保守基序（RUM或Drr）位于逆轉(zhuǎn)座子插入位置上游被R2的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的ZF基序、Myb基序與RT結(jié)構(gòu)域共同識(shí)別。另一段保守基序（RASIN或Dcr）則涉及插入位點(diǎn)的切割，其在整合過程中靠近R2蛋白的核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域并被解旋，隨后由R2蛋白的內(nèi)切酶活性切割第一條靶DNA鏈，暴露出3'羥基。

第一條鏈切割后，R2蛋白的RT啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄過程，利用切口處暴露的DNA的3'羥基與R2 RNA模板開始第一條cDNA鏈的合成，這一過程被稱為靶標(biāo)引發(fā)的逆轉(zhuǎn)錄（TPRT）。

第一條cDNA鏈的合成完成后，R2蛋白的核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域啟動(dòng)第二條DNA鏈的切割。逆轉(zhuǎn)錄完成后，3' UTR被移除，5' RNA與蛋白形成的復(fù)合物開始激活第二條鏈的切割。隨后第二條cDNA鏈起始合成，最后通過DNA修復(fù)完成整個(gè)整合（圖3）。

盡管已經(jīng)有不少針對(duì)R2逆轉(zhuǎn)座子整合機(jī)制的研究，但仍存在一些細(xì)節(jié)有待解析。對(duì)R2逆轉(zhuǎn)座子的獨(dú)特整合機(jī)制的進(jìn)一步理解為大片段基因整合工具開發(fā)提供了新的視野。

圖3 R2逆轉(zhuǎn)座子的TPRT機(jī)制示意

2.2 R2逆轉(zhuǎn)座子的研究進(jìn)展

R2逆轉(zhuǎn)座子整合的特異性與形成RNA中間體的特性，使其成為開發(fā)全RNA形式的精準(zhǔn)靶向基因整合工具的有力候選系統(tǒng)。2019年，Kuroki?Kami等就嘗試將來源于青鳉魚的R2Ol逆轉(zhuǎn)座子用于在斑馬魚中實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性整合，并且在斑馬魚生殖細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高效的EGFP整合（高達(dá)95%），但R2Ol逆轉(zhuǎn)座子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上R2Ol逆轉(zhuǎn)座子的表現(xiàn)并不理想。2023年，Wilkinson等針對(duì)R2Bm做了結(jié)構(gòu)解析，闡釋了R2Bm逆轉(zhuǎn)座過程中TPRT起始的分子機(jī)制，同時(shí)在體外證明了R2Bm可通過Cas9的重編程性質(zhì)實(shí)現(xiàn)對(duì)非28S rDNA位點(diǎn)的靶向。同期，Luan等鑒定并解析了R2Bm逆轉(zhuǎn)座過程中R2 RNA組分中5' RNA與3' UTR的調(diào)控功能。

2024年，Zhang等與Chen等各自獨(dú)立開發(fā)了可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)全RNA介導(dǎo)的靶向基因整合的R2工具。其中，Zhang等開發(fā)了精確RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因插入（PRINT）技術(shù)。而Chen等通過系統(tǒng)的工程化改造開發(fā)的en?R2Tg工具，具有極高的靶向整合特異性（高達(dá)99%）和極好的整合精確度，約90%的5'端被精確整合到28S rDNA預(yù)定位點(diǎn)。2025年，F(xiàn)ell等利用SpCas9H840A與R2Tocc逆轉(zhuǎn)座子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了一定程度的R2的重編程基因插入。 隨后，Edmonds等解析鳥類R2逆轉(zhuǎn)座子（R2Tg）的結(jié)構(gòu)與生化機(jī)制，可完成高精準(zhǔn)度的靶向基因插入。2026年，McIntyre等進(jìn)一步闡明R2逆轉(zhuǎn)錄子介導(dǎo)基因插入的分子機(jī)制，系統(tǒng)揭示ATR?Polθ、53BP1?Shieldin?CST?Polα及CtIP?MRN 3條宿主修復(fù)通路分別調(diào)控微同源連接、截短插入與全長精準(zhǔn)整合。

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結(jié)論與展望

相較于CRISPR同源重組，PE結(jié)合重組酶等DNA依賴型大片段基因整合工具，R2逆轉(zhuǎn)座子以全RNA遞送模式為核心，擺脫了外源DNA導(dǎo)入帶來的細(xì)胞毒性與免疫原性問題，具有易遞送、定點(diǎn)整合安全性高等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，適用于原代免疫細(xì)胞改造與體內(nèi)基因編輯研究。然而，目前這類工具仍存在整合位點(diǎn)固定、可編程性不足、大片段整合易形成截短插入產(chǎn)物、整體整合效率偏低等缺陷。

R2逆轉(zhuǎn)座子工具有望開發(fā)在體功能基因回補(bǔ)、在體生成嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR?T）細(xì)胞等全新的疾病治療方法，首先，對(duì)于許多單基因遺傳病而言，導(dǎo)致疾病發(fā)生的致病點(diǎn)突變往往并不唯一，相同表型可能存在不止一個(gè)致病點(diǎn)突變。相較而言，利用R2逆轉(zhuǎn)座子編輯工具回補(bǔ)正常功能性基因，有望構(gòu)建通用基因治療方案。此外，CAR?T細(xì)胞療法，目前已經(jīng)在治療血液系統(tǒng)的惡性腫瘤中展現(xiàn)出顯著的療效。R2逆轉(zhuǎn)座子的全RNA形式，可通過非病毒載體進(jìn)行遞送，無需體外細(xì)胞改造與病毒包裝流程，有望實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)直接生產(chǎn)CAR?T細(xì)胞。并且相較于單純mRNA瞬時(shí)遞送，R2逆轉(zhuǎn)座子的靶向DNA整合可實(shí)現(xiàn)CAR分子的持續(xù)表達(dá)。并且全RNA遞送模式無外源DNA與病毒骨架摻入，顯著降低免疫原性，制備流程精簡且成本可控。R2逆轉(zhuǎn)座子作為一類全新的基因整合工具，通過全RNA遞送可實(shí)現(xiàn)精確的基因整合，從而為開發(fā)全新的療法提供了一個(gè)可擴(kuò)展的生物技術(shù)平臺(tái)。現(xiàn)有的R2逆轉(zhuǎn)座子工具在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的基因整合效率仍有很大的提升空間，而隨著未來對(duì)R2逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)、整合機(jī)制的深入解析，有望利用這種獨(dú)特的可移動(dòng)元件設(shè)計(jì)出更高效的、全RNA遞送與可編程的基因整合工具。

本文作者：汪彧澤、毛邦煒、駱勝球、陳陽燦、李偉

作者簡介：汪彧澤，中國科學(xué)院動(dòng)物研究所器官再生與智造全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中國科學(xué)院大學(xué)，博士研究生，研究方向?yàn)榛蚓庉嫾夹g(shù)的開發(fā)與應(yīng)用；李偉（通信作者），中國科學(xué)院動(dòng)物研究所器官再生與智造全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中國科學(xué)院大學(xué)、北京干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究院，研究員，研究方向?yàn)椴溉閯?dòng)物工程生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)，哺乳動(dòng)物器官再生修復(fù)機(jī)制與技術(shù)，重大疾病生物治療新方法。

文章來 源 ： 汪彧澤, 毛邦煒, 駱勝球, 等. R2逆轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的大片段基因整合技術(shù)新進(jìn)展[J]. 科技導(dǎo)報(bào), 2026, 44(11): 24?32.

本文有刪改，

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