Hepatology (1區，IF=18.0)丨MASH新靶點GPR75：通過GNAI2-cAMP-PKA軸加重肝脂質合成與纖維化！(謝媛/王廣基—中國...

2026年2月3日，中國藥科大學謝媛、王廣基團隊等，聯合中國藥科大學南京鼓樓醫院，在Hepatology（中科院1區，IF=18.0）在線發表題為 “Hepatic GPR75 exacerbates MASH through GNAI2-dependent signaling” 的研究論文。該文于2025年9月23日投稿，2026年1月20日接收。Hepatology 為肝病學領域權威期刊，2026 JCR Impact Factor=18.0；按常用中科院期刊分區信息，該刊位于醫學大類1區、胃腸肝病學小類1區。

這項研究聚焦代謝功能障礙相關脂肪性肝炎（MASH）進展中的肝臟 GPR75。研究發現，健康狀態下肝臟 GPR75 表達并不豐富，但在 MASH 過程中其蛋白水平明顯升高。無論是全肝敲低 Gpr75，還是肝細胞特異性敲除 Gpr75，均可減輕飲食誘導的小鼠肝脂肪變性、炎癥和纖維化；相反，肝細胞特異性過表達 Gpr75 會加重 MASH 表型。機制上，GPR75 與 GNAI2 相互作用，并通過 GNAI2-cAMP-PKA 信號軸影響 SREBP-1c成熟和肝臟新生脂肪生成；同時，VPS35 可將 GPR75 回收至肝細胞膜，從而穩定其蛋白水平。研究還篩選出小分子化合物 X201415，提示靶向 GPR75 可能為 MASH 干預提供新的研究方向。

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【摘 要】

代謝功能障礙相關脂肪性肝病（MASLD）及其更嚴重的形式——代謝功能障礙相關脂肪性肝炎（MASH），正日益成為重要的全球健康問題。本研究旨在探討肝臟 GPR75 在 MASH 進展中的作用。

盡管在健康個體中，GPR75 在肝臟中的表達并不豐富，但其蛋白水平在 MASH 過程中顯著升高。無論是在全肝范圍內減少 Gpr75，還是在肝細胞中特異性減少 Gpr75，均可保護小鼠免受飲食誘導的肝脂肪變性；相反，肝細胞特異性過表達 Gpr75 會加重飲食誘導的 MASH 和肝纖維化。肝臟 Gpr75 缺失可激活 MASLD 小鼠肝臟中的 GNAI2-cAMP-PKA 信號通路，從而減少 SREBP-1c 成熟和新生脂肪生成。機制上，VPS35 可通過將 GPR75 回收至肝細胞膜來穩定 GPR75，從而在 MASH 進展過程中減少其降解。

本研究表明，GPR75 可通過調控肝臟脂肪酸代謝，作為 MASLD/MASH 的新型調節因子。這些發現提示，抑制 GPR75 可能成為 MASLD/MASH 治療的潛在策略。

關鍵詞：新生脂肪生成，GNAI2，GPR75，MASH，VPS35

01

研究背景及科學問題

代謝功能障礙相關脂肪性肝炎（MASH，既往稱為非酒精性脂肪性肝炎，NASH）是代謝綜合征在肝臟中的表現，目前已成為慢性肝病的主要病因。其關鍵病理特征之一是肝臟脂質代謝失衡，涉及脂質合成、儲存、動員和分解代謝等多個環節。肝脂肪變性是 MASLD 發生發展的早期標志，主要源于過量游離脂肪酸在細胞質脂滴中以三酰甘油形式儲存；這些游離脂肪酸可來自循環輸入增加，也可來自肝內新生脂肪生成。然而，肝內三酰甘油長期堆積可通過脂質過氧化促進肝臟胰島素抵抗和肝細胞損傷，并進一步驅動 MASH 相關炎癥和纖維化。過去十年間，MASLD 的全球患病率明顯升高，但針對該疾病的藥物治療選擇仍然有限。

G 蛋白偶聯受體 75（GPR75）是 GPCR 家族中的孤兒受體，廣泛表達于人體多個組織，包括腦、視網膜、腎臟、心臟和前列腺。人類遺傳學研究發現，GPR75 基因變異與體脂減少和體重指數降低有關。與人類數據一致，在小鼠中刪除 Gpr75 可抵抗高脂飲食（HFD）誘導的肥胖，改善胰島素敏感性，并增強血糖控制。此外，對 UK Biobank 428,719 名參與者全外顯子測序數據的分析顯示，GPR75 變異與肝脂肪變性風險降低相關；在小鼠中遺傳性失活 Gpr75 也可防止 NAFLD 并減少脂肪積累。這些發現共同提示，GPR75 主要在腦內表達，并可能通過調控攝食影響肥胖和肝脂肪變性。然而，GPR75 調控 MASH 的機制仍不清楚，GPR75 是否直接調節肝臟和脂肪組織中的脂質積累也尚未明確。

近期研究發現，RANTES（CCL5）和 20-羥基二十碳四烯酸（20-HETE）是 GPR75 的內源性配體。CCL5 在肝臟炎癥和纖維化進展中發揮重要作用。花生四烯酸可被細胞色素 P450 酶 4A 和 4F 家族代謝生成 20-HETE，而 20-HETE 對激活 GPR75 受體、誘導血管收縮和細胞增殖具有重要意義。已有研究顯示，20-HETE 可促進高脂飲食小鼠發生胰島素抵抗，而 20-HETE 受體阻斷劑可預防這一過程。趨化因子 CCL5 可在 GPR75 過表達細胞、胰島和神經母細胞瘤細胞系中，通過 Gqα 蛋白介導的信號轉導通路激活 GPR75。研究者還觀察到 GPR75 可與 Gi-arrestin 和 β-arrestin 發生組成性偶聯。

盡管某些促進瘦體型的遺傳改變反而可能增加脂肪肝風險，但 GPR75 在肝臟中的作用仍未得到充分探索。為彌補這一空白，作者研究了 GPR75 在 MASLD 中的功能。本研究顯示，肝細胞特異性敲除 Gpr75（Gpr75fl/fl TBGCre）可減輕肝臟脂質積累，而肝細胞中過表達 Gpr75 則會加重高脂飲食誘導小鼠的 MASH。隨后，研究者鑒定出 GNAI2 是與 GPR75 偶聯的 G 蛋白，并發現 GPR75 可通過 GNAI2-cAMP-PKA 通路抑制 SREBP 家族蛋白（SREBP1c/2）的表達，從而影響新生脂肪生成和炎癥反應。最后，研究者證明，GPR75 蛋白水平受 VPS35 影響；VPS35 是 retromer 復合體中的重要組分，可將 GPR75 運回細胞膜并維持其蛋白水平。本研究也提出，GPR75-GNAI2 通路可能是 MASH 的潛在治療靶點。

02

重要發現及亮點

肝臟 GPR75 蛋白在 MASH 患者和小鼠肝臟中上調

既往大規模外顯子測序研究發現，GPR75 功能缺失變異與抗肥胖相關。已有證據表明，GPR75 在小鼠腦組織中高表達，但在肝臟中的 mRNA 表達較低。作者首先基于 Gene Expression Omnibus（GEO）數據庫分析發現，與正常對照相比，無論是 MASH 患者還是小鼠肝臟中，GPR75 mRNA 水平均未出現顯著變化。值得注意的是，免疫組織化學染色顯示，在人肝組織樣本中，GPR75 蛋白水平從 MASH 到肝纖維化呈逐漸升高趨勢。

在小鼠模型中，作者使用高脂飲食（HFD）或膽堿缺乏、L-氨基酸定義高脂飲食（CDAHFD）誘導 MASH。多種 qRT-PCR 檢測均顯示，肝臟 Gpr75 mRNA 表達并無顯著變化。進一步通過 Western blot 檢測蛋白水平時，作者以小鼠腦組織作為陽性對照，并使用 GPR75 抗體封閉肽驗證抗體特異性。結果顯示，HFD 和 CDAHFD 飲食均可使小鼠肝臟 GPR75 蛋白水平升高，提示 GPR75 在 MASH 中可能受到轉錄后調控。免疫熒光染色也進一步證實，在 MASH 進展過程中，肝臟 GPR75 蛋白表達增加。

圖1：MASH 患者和小鼠肝臟中肝臟 GPR75 蛋白表達上調。（A）基于 Gene Expression Omnibus（GEO）數據庫公開數據集（GSE48452、GSE89632、GSE32095、GSE35961）分析 GPR75 mRNA 的基因表達。（B）在人正常對照肝組織（n = 7）以及 MASH 和纖維化患者肝組織（n = 6）切片中進行 GPR75 免疫組織化學染色。陽性染色區域使用 ImageJ 軟件進行定量。比例尺：100 μm。（C）左圖：高脂飲食（HFD）喂養 16 周小鼠肝組織切片的代表性 H&E 染色和油紅 O 染色（n = 6）。比例尺：100 μm。右圖：采用 TaqMan 探針和 SYBR Green qRT-PCR 檢測 HFD 喂養小鼠肝臟中 Gpr75 mRNA 表達（n = 6）。下方：HFD 喂養小鼠肝臟中 GPR75 蛋白水平（n = 4 個生物學重復/組）。（D）左圖：CDAHFD 喂養 6 周小鼠肝組織切片的 H&E 染色和油紅 O 染色（n = 6）。比例尺：100 μm。右圖：采用 TaqMan 探針和 SYBR Green qRT-PCR 檢測 CDAHFD 喂養小鼠肝臟中 Gpr75 mRNA 表達（n = 6）。下方：CDAHFD 喂養小鼠肝臟中 GPR75 蛋白水平（n = 4 個生物學重復/組）。（E，F）HFD（E）或 CDAHFD（F）喂養小鼠肝臟中 GPR75 的免疫熒光染色。比例尺：50 μm（n = 6）。所有圖中：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns 表示無統計學意義。數據以 mean ± SEM 表示；采用雙尾非配對 Student t 檢驗。縮寫：CDAHFD，膽堿缺乏、L-氨基酸定義高脂飲食；GPR75，G 蛋白偶聯受體 75；HFD，高脂飲食；MASH，代謝功能障礙相關脂肪性肝炎；ND，普通飲食。

肝臟 Gpr75 缺失減輕 MASH 進展

為明確肝臟 GPR75 上調是否介導 MASH 進展，作者構建了腺相關病毒 8 型（AAV8）介導的肝臟 Gpr75 敲低小鼠，并給予 CDAHFD 飲食。mRNA 和蛋白水平均證實敲低有效。Gpr75 敲低顯著降低肝臟重量/體重比，但未影響整體體重。組織學分析顯示，肝臟 Gpr75 敲低小鼠的肝內脂質積累和氣球樣變減輕，同時肝臟三酰甘油（TG）、總膽固醇和非酯化脂肪酸水平均下降。進一步檢測脂質代謝相關基因后發現，降低肝臟 GPR75 表達可下調脂肪酸和 TG 合成相關基因，而對脂肪酸 β-氧化或攝取相關基因影響不明顯。這提示 GPR75 可能主要影響肝臟脂肪酸合成過程。

鑒于脂毒性、肝細胞損傷、炎癥和纖維化在 MASH 進展中具有核心作用，作者進一步評估 Gpr75 敲低對這些病理特征的影響。Masson 染色、天狼星紅染色以及肝星狀細胞活化標志蛋白 α-SMA 染色均提示，Gpr75 敲低可減少肝臟膠原沉積面積。此外，促炎性 M1 型巨噬細胞標志物 CD11b 和 F4/80 的表達顯著降低。Western blot 和免疫熒光染色也證實 α-SMA 蛋白水平明顯下降。q-PCR 分析進一步顯示，Gpr75 敲低小鼠肝臟中關鍵纖維化相關基因 Col1a1、Tgfβ、Ctgf 以及炎癥相關基因 Tnfα、Il1β、Il6、Mcp1 的 mRNA 表達均下調。血清 ALT 和 AST 水平下降也支持其對 MASH 進展的保護作用。總體而言，這些數據表明，降低 Gpr75 表達可抵抗飲食誘導的 MASH 和肝脂肪變性。

圖2：肝臟 Gpr75 缺失減輕 MASH 進展。（A）用于研究 Gpr75 在 MASH 中作用的小鼠肝臟 Gpr75 敲低示意圖。（B）對照組和 shGpr75 小鼠的肝臟重量/體重比（n = 7）。（C）肝組織切片代表性 H&E 染色和油紅 O 染色。比例尺：100 μm（n = 6）。（D）肝臟甘油三酯、總膽固醇和游離脂肪酸（FFA）水平（n = 7）。（E）qRT-PCR 分析肝組織中與脂質攝取、脂肪酸 β-氧化和脂肪酸合成相關的基因（n = 7）。（F）Masson 染色和免疫組織化學（IHC）分析肝纖維化。比例尺：100 和 200 μm（n = 6）。（G）α-SMA 相對蛋白水平。GAPDH 作為上樣對照（n = 6 個生物學重復/組）。（H，I）與肝臟炎癥（H，n = 6）和纖維化（I，n = 7）相關基因的 mRNA 表達。（J）血清 ALT 和 AST 水平（n = 7）。所有圖中：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns 表示無統計學意義。數據以 mean ± SEM 表示；采用雙尾非配對 Student t 檢驗。縮寫：AAV8，腺相關病毒 8 型；Acc1，乙酰輔酶 A 羧化酶 1；Cd36，分化簇 36；COL1A1，膠原 1a1；Cpt-1α，肉堿棕櫚酰轉移酶 1α；Cpt-2，肉堿棕櫚酰轉移酶 2；Ctgf，結締組織生長因子；Dgat，二酰甘油酰基轉移酶；Fasn，脂肪酸合酶；Gpat，甘油-3-磷酸酰基轉移酶；Mcp1，單核細胞趨化蛋白 1；Tgfβ，轉化生長因子 β；NEFA，非酯化脂肪酸；Pparα，過氧化物酶體增殖物激活受體 α；Scd1，硬脂酰輔酶 A 去飽和酶 1；Srebp-1c，固醇調節元件結合蛋白 1c；TC，總膽固醇；TG，甘油三酯；Tnfα，腫瘤壞死因子 α；α-SMA，α-平滑肌肌動蛋白。

肝細胞特異性 Gpr75 缺失改善肝脂肪變性和組織損傷

為了明確 MASH 肝臟中上調的 GPR75 主要位于哪些細胞，作者進行了免疫熒光染色。結果顯示，GPR75 主要在 Albumin 陽性肝細胞中增加。此外，棕櫚酸（PA）處理后，小鼠原代肝細胞和 HepG2 細胞中的 GPR75 水平均升高。因此，作者構建了肝細胞特異性 Gpr75 缺失小鼠（Gpr75hko，基因型為 Gpr75fl/fl TBGCre），并給予 CDAHFD 飲食 8 周。肝組織免疫熒光染色證實 GPR75 成功刪除。與 Gpr75fl/fl 對照小鼠相比，Gpr75hko 小鼠肝臟重量/體重比較低，H&E、油紅 O 和 Masson 染色顯示其肝脂肪變性更輕。

這一保護性表型還表現為血清 ALT 和 AST 水平降低，肝臟 TG 和非酯化脂肪酸含量下降，以及脂質代謝相關基因表達下調。同時，與 Gpr75fl/fl 對照相比，Gpr75hko 小鼠肝臟中 α-SMA 和細胞外基質標志物表達降低，提示纖維化減輕；巨噬細胞浸潤減少，炎癥因子 Il-1β、Il-6 和 Tnfα 水平也下降。

進一步在 12 周 HFD 模型中驗證時，肝細胞特異性 Gpr75 消融并未改變食物攝入，但 Gpr75hko 小鼠體重增加較少，并表現出更低的空腹血糖和更強的胰島素敏感性，提示其系統代謝狀態改善。肝細胞特異性 Gpr75 缺失也可減輕肝脂肪變性、降低 TG 含量，并使血漿 ALT、TG 和總膽固醇水平下降。脂肪酸合成相關基因表達也發生相應變化。基于質譜成像的質荷比計算還顯示，Gpr75hko 小鼠肝臟中疑似 TG、二酰甘油和膽固醇酯明顯減少。

總體而言，這些結果表明，在 HFD 喂養小鼠中，肝細胞特異性刪除 Gpr75 可改善已形成 MASH 的關鍵病理特征，包括肝脂肪變性、纖維化、炎癥和肝損傷。

圖3：肝細胞特異性 Gpr75 缺失改善肝脂肪變性和組織損傷。（A）CDAHFD 喂養 8 周小鼠肝組織切片中 GPR75（紅色）和 Albumin（綠色）的免疫熒光染色。比例尺：50 μm（n = 5）。（B）通過 Western blot 檢測原代肝細胞和 HepG2 細胞中 GPR75 的相對蛋白水平（n = 5–6 個生物學重復/組）。（C）上方：MASH 飲食喂養條件下肝細胞特異性 Gpr75 敲除小鼠示意圖。下方：Gpr75fl/fl 和 Gpr75hko 小鼠中 GPR75 的免疫熒光分析。比例尺：50 μm（n = 7）。（D）Gpr75fl/fl 和 Gpr75hko 小鼠肝臟重量/體重比（n = 7）。（E）肝組織切片代表性 H&E、Masson 三色和油紅 O 染色。比例尺：200 μm（n = 6）。（F）血清 ALT 和 AST 活性，以及 TG 和 NEFA 水平（n = 7）。（G）肝組織中脂質代謝相關基因的 mRNA 表達（n = 7）。（H）qRT-PCR 分析纖維化相關基因表達（n = 7）。（I）F4/80 免疫熒光染色。比例尺：100 μm（n = 3）。（J）炎癥相關基因的相對 mRNA 表達（n = 7）。所有圖中：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns 表示無統計學意義。數據以 mean ± SEM 表示；采用雙尾非配對 Student t 檢驗。縮寫：Acta2，平滑肌 α2 肌動蛋白；NEFA，非酯化脂肪酸；PA，棕櫚酸；Pdgfβ，血小板源性生長因子 β 亞基；TC，總膽固醇；TG，甘油三酯；Timp，金屬蛋白酶組織抑制因子。

肝細胞特異性過表達 Gpr75 加重飲食誘導的 MASH 和纖維化

為判斷肝臟 Gpr75 過表達是否會加重 MASH，作者在小鼠中利用 AAV8 介導肝細胞特異性 Gpr75 過表達。在 6 周 CDAHFD 挑戰下，與對照組相比，Gpr75 水平升高使肝臟重量/體重比增加，并加重肝脂肪變性、纖維化和巨噬細胞浸潤。這些變化伴隨血清 ALT 和 AST 活性升高，以及肝臟 TG、總膽固醇和非酯化脂肪酸水平升高。定量 PCR 分析顯示，肝細胞特異性 Gpr75 過表達小鼠中新生脂肪生成、纖維化和炎癥相關基因上調，提示肝損傷和炎癥反應增強。

隨后，作者在 HFD 誘導小鼠模型中進一步考察 Gpr75 過表達的影響。從第 8 周開始，Gpr75 過表達小鼠體重增長顯著增加，但食物攝入無明顯變化，同時糖代謝穩態受損。Gpr75 過表達可促進更嚴重的肝脂肪變性和損傷，表現為組織學改變、血清 AST 升高以及肝臟/血清脂質水平升高。該表型與脂肪生成基因表達增強和肝臟游離脂肪酸升高相關。蛋白水平和免疫熒光分析提示，GPR75 可能通過抑制 PKA 磷酸化，上調核內 SREBP-1c，從而促進脂質積累。

總之，與 Gpr75hko 小鼠的表型相反，肝細胞特異性 Gpr75 過表達會加重飲食誘導的脂肪變性、炎癥和代謝功能障礙，說明 GPR75 是推動 MASLD/MASH 進展的重要因子。

圖4：肝細胞特異性過表達 Gpr75 加重飲食誘導的 MASH 和纖維化。（A）在肝細胞特異性 Gpr75 過表達小鼠中通過 CDAHFD 喂養誘導 MASH 的實驗時間線。（B）肝臟重量/體重比（n = 8）。（C）肝組織切片代表性 H&E 和油紅 O 染色。比例尺：200 μm（n = 5）。（D）血清 ALT 和 AST 水平（n = 8）。（E）肝臟 TG、TC 和 NEFA 含量（n = 8）。（F）參與脂肪酸（FA）代謝相關基因的 mRNA 表達（n = 7）。（G）通過 Masson 染色和免疫組織化學評估肝纖維化。比例尺：200 μm（n = 5）。（H）α-SMA 和 COL1A1 的相對蛋白表達，并以 GAPDH 歸一化（n = 6 個生物學重復/組）。（I）纖維化相關基因的 mRNA 表達（n = 7）。（J）炎癥相關基因的 mRNA 表達（n = 7）。所有圖中：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns 表示無統計學意義。數據以 mean ± SEM 表示；采用雙尾非配對 Student t 檢驗。縮寫：FA，脂肪酸；NEFA，非酯化脂肪酸；TC，總膽固醇；TG，甘油三酯。

GPR75 與 GNAI2 相互作用并調控脂肪酸合成

為研究 GPR75 作為 G 蛋白偶聯受體是否通過 G 蛋白偶聯促進 MASH 進展，作者對 CDAHFD 喂養的對照小鼠和肝臟 Gpr75 敲低小鼠肝臟進行了蛋白質組學分析。Gene Ontology 富集分析顯示，催化活性、GTP 結合和過氧化物酶體功能相關通路發生改變。基因集富集分析進一步將 GPR75 與脂肪酸代謝、GTPase 活性和 NF-κB 信號聯系起來。更重要的是，火山圖分析發現，Gpr75 敲低后抑制性 G 蛋白亞基 Gαi2（由 Gnai2 編碼）顯著下降。

既往研究提示，在蛋氨酸和膽堿缺乏飲食喂養小鼠中，肝臟 Gnai2 刪除可減輕脂肪性肝炎，抑制炎癥標志物，并增強脂滴自噬。也有研究顯示，Gnai2 轉錄表達可通過 TLR4-TRAF6 依賴性機制受 NF-κB 上調，形成 GNAI2 與 NF-κB 之間的正反饋環路，從而促進 NASH 中的慢性炎癥狀態。本研究中，Gpr75 敲低和敲除均降低 GNAI2 的 mRNA 和蛋白表達，而 Gpr75 過表達則升高其表達。為確定 GNAI2 是否與 GPR75 相互作用，作者在 PA 處理的 HepG2 細胞中進行了 Co-IP 實驗，證實 GNAI2 與 GPR75 存在相互作用；MASH 小鼠肝臟中二者強烈共定位也支持這一結果。

多數 GPCR 可通過一種或多種 G 蛋白發出信號，并作用于腺苷酸環化酶（AC）、磷脂酶 C、離子通道和 cGMP 磷酸二酯酶等下游效應分子。AC 催化第二信使 cAMP 的合成，cAMP 隨后結合 PKA 調節亞基，釋放有活性的 PKAc 亞基。作者推測，GNAI2 的募集在 GPR75 加重 MASH 進展的致病作用中具有關鍵意義，即通過抑制 AC 活性而不是被 AC 抑制。Gpr75 過表達可通過 GNAI2 抑制 PKA 活性，從而調節細胞內信號分子并促進 SREBP-1c 表達；相反，Gpr75 敲除解除對 GNAI2 相關通路的抑制，增強 PKA 磷酸化活性，進而降低 SREBP-1c 水平。

在 HepG2 細胞中，shGPR75 慢病毒感染可降低 SREBP-1c、TG 和 IL-1β 水平，同時增加 PKA 磷酸化。SREBP 家族蛋白，尤其是 SREBP1c 和 SREBP2，是調控肝細胞新生脂肪生成、膽固醇代謝和炎癥信號通路的關鍵核轉錄因子，參與 MASLD 形成。更重要的是，多項證據表明，PKA 可磷酸化 SREBP-1c，從而減弱其轉錄活性或調控前體 SREBP-1c 成熟，并提示 PKA 可能通過減少脂質合成發揮作用。GPR75 缺失可顯著降低 SREBP-1c 的核轉位，以及 SREBP-1c 前體形式和成熟形式。相反，在肝細胞中過表達 GPR75 可有效抑制 PKA 磷酸化，同時增加 SREBP-1c 蛋白水平和 TG 含量；而在慢病毒轉導建立的穩定細胞系中，沉默 GNAI2 可削弱這些效應。

為了在體內驗證 GPR75 與 GNAI2 的功能關系，作者向小鼠共同給予 AAV-TBG-Gpr75 或 AAV-TBG-Gpr75-shGnai2。Gnai2 敲低可緩解 Gpr75 過表達誘導的肝腫大和肝脂肪變性，表現為肝重降低、H&E 和油紅 O 染色提示組織學改善，以及 TG 水平下降。此外，GPR75 對新生脂肪生成相關基因的上調作用也受到抑制。為說明 GNAI2 對 GPR75 介導的肝損傷、炎癥和纖維化進展的貢獻，作者檢測了血清 AST 水平以及 α-SMA 和 F4/80 蛋白水平。結果顯示，Gnai2 沉默顯著減輕 Gpr75 過表達誘導的嚴重 MASH 進展。與預期一致，Gpr75 過表達抑制 PKA 活性，導致 PKA 底物磷酸化減少；而 Gnai2 敲低后，GPR75 對 PKA 的這一調控作用被取消。總體來看，數據強烈提示，抑制 Gnai2 可顯著減輕 Gpr75 過表達誘導的肝臟炎癥和纖維化。

圖5：GPR75 與 GNAI2 相互作用并調控脂肪酸合成。（A）GO 富集分析和（B）火山圖顯示顯著富集的信號通路和差異表達蛋白。（C）在 HepG2 細胞中使用抗 Flag 和 GNAI2 抗體進行免疫沉淀（n = 3 個生物學重復/組）。（D）免疫熒光染色顯示肝組織切片中 GPR75（綠色）和 GNAI2（紅色）共定位（n = 3）。（E）CDAHFD 喂養后，對照組、Gpr75 過表達組、Gpr75fl/fl 組和 Gpr75hko 小鼠肝臟中蛋白水平的免疫印跡分析（n = 3 個生物學重復/組）。（F–H）在轉導 LV-C（對照）、LV-GPR75 或 LV-GPR75-siGNAI2 慢病毒載體的 HepG2 細胞中進行分析。（F）p-PKA 和總 PKA 蛋白水平（n = 3 個生物學重復/組）。（G）采用 Nile Red 染色評估脂質積累。（H）細胞內 TG 含量。（I）AAV8-TBG、AAV8-TBG-Gpr75 以及 AAV8-TBG-Gpr75 + AAV8-TBG-shGnai2 共感染小鼠在 CDAHFD 喂養 8 周條件下的實驗時間線。（J）肝臟重量/體重比（n = 10）。（K）肝組織切片代表性 H&E、油紅 O 和 Masson 三色染色。比例尺：200 μm（n = 5）。（L）肝臟 TG 和 NEFA 水平（n = 10）。（M）p-PKA、PKA 底物磷酸化、總 PKA 和 SREBP-1c 的 Western blot 分析（n = 3 個生物學重復/組）。所有圖中：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns 表示無統計學意義。數據以 mean ± SEM 表示；E 采用雙尾非配對 Student t 檢驗；F–H、J 和 M 采用單因素方差分析。縮寫：GNAI2，鳥嘌呤核苷酸結合蛋白 G(i) α-2 亞基；GO，基因本體；PKA，蛋白激酶 A；SREBP-1c，固醇調節元件結合蛋白 1c；TG，甘油三酯。

VPS35 通過將 GPR75 回收至肝細胞表面維持 GPR75 表達

為解釋 MASH 中 GPR75 蛋白水平升高而 mRNA 表達不變這一現象，作者研究了 GPR75 蛋白降解。PA 暴露后，GPR75 降解速率減慢。通過免疫沉淀聯合質譜鑒定 GPR75 相互作用蛋白時，作者發現了多個與蛋白降解通路相關的候選蛋白，包括 UBE2N。然而，UBE2N 與 GPR75 之間未發現直接相互作用；使用 UBE2N 抑制劑 NSC697923 處理后，GPR75 泛素化水平也幾乎無變化。

GO 生物過程分析顯示，囊泡介導轉運相關通路顯著富集。其中，VPS35 被鑒定出來。VPS35 是 retromer 復合體的核心組分，可介導與待回收分選受體之間的相互作用。值得注意的是，VPS35 與 GPR75 在 HepG2 細胞和 CDAHFD 誘導的小鼠肝臟中均顯示明顯細胞內共定位。Co-IP 實驗也證實 VPS35 與 GPR75 可相互結合，提示 VPS35 可能促進 GPR75 分選并運回細胞膜，而不是進入溶酶體或蛋白酶體降解途徑。

無論是否給予 CCL5 刺激，VPS35 沉默均可加速 GPR75 降解，并顯著減輕 PA 誘導的肝細胞脂質積累，支持 VPS35 在穩定 GPR75 中具有必要作用。更重要的是，免疫印跡和免疫熒光分析證實，GPR75 上調主要發生在細胞膜，而細胞質中并未顯著增加。這進一步表明，VPS35 可促進 GPR75 回收到細胞表面，從而增強其膜定位并減少降解。與此一致，siVPS35 增強了 GPR75 與溶酶體標志物 LAMP1 的共定位。這些結果提示，VPS35 可將 GPR75 分選并回收到質膜，從而維持其高表達和功能活性。

與其致病作用一致，VPS35 在飲食誘導小鼠和 MASH 患者肝臟中均上調。為研究其功能意義，作者使用 AAV8-TBG-shVps35 在 CDAHFD 誘導小鼠中敲低肝臟 Vps35。肝臟 Vps35 缺失可改善 MASH 表型，表現為肝臟重量/體重比下降、TG 和游離脂肪酸水平降低、脂肪生成相關基因表達受抑制，以及組織學改善。同時，Vps35 敲低可阻斷 CDAHFD 誘導的肝損傷，顯著減少肝臟內 F4/80 陽性巨噬細胞積累，降低肝臟 α-SMA 陽性面積，并改善肝損傷。最重要的是，Vps35 敲低小鼠中 GPR75 蛋白表達顯著降低，而轉錄水平未發生變化。就 GPR75 下游通路而言，Vps35 敲低可激活 PKA 磷酸化，與肝臟 Gpr75 敲低的效應相似。總體而言，這些數據提示，Vps35 敲低可減少 GPR75 運回肝細胞膜，并且 VPS35 表達與 MASH 嚴重程度呈正相關。

圖6：VPS35 通過將 GPR75 回收至肝細胞表面來維持 GPR75 表達。（A）HepG2 細胞在有或無 PA 刺激條件下，隨后給予環己酰亞胺（CHX，100 μg/mL）處理 0、2、4 和 6 小時后，GPR75 的相對蛋白表達（n = 3 個生物學重復/組）。（B）IP-MS 實驗示意圖。（C，D）HepG2 細胞中 GPR75 與 VPS35 相互作用的 Co-IP 分析（n = 2 個生物學重復/組）。（E）熒光成像顯示 AML12 細胞中 GPR75 和 VPS35 共定位。（F）HepG2 細胞中 GPR75 的相對蛋白水平（n = 3 個生物學重復/組）。（G）HepG2 細胞中的 TG 含量。（H）HepG2 細胞膜蛋白和胞質蛋白的免疫印跡分析。（I）AML12 細胞中 GPR75 的共聚焦顯微鏡圖像。比例尺：15 μm。（J）GPR75（紅色）與 LAMP1（綠色）的共定位分析。比例尺：15 μm。（K）CDAHFD 喂養 8 周小鼠中肝細胞特異性 Vps35 敲低的實驗設計。（L）小鼠肝臟重量/體重比（n = 10）。（M）肝組織切片代表性 H&E、油紅 O 和 Masson 染色。比例尺：200 μm（n = 5）。（N）肝臟 TG 和 NEFA 水平（n = 10）。（O）肝組織中 VPS35、GPR75、p-PKA、PKA 和 SREBP-1c 的相對蛋白表達（n = 3 個生物學重復/組）。所有圖中：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns 表示無統計學意義。數據以 mean ± SEM 表示；G–I 采用單因素方差分析；A、F 和 L–O 采用雙尾非配對 Student t 檢驗。縮寫：CCL5，C-C 基序趨化因子配體 5；LAMP1，溶酶體相關膜糖蛋白 1；PA，棕櫚酸；TG，甘油三酯；VPS35，液泡蛋白分選相關蛋白 35。

肝臟 GPR75 是篩選 MASH 治療化合物的潛在靶點

基于上述數據，作者利用計算機輔助分子對接（AutoDock 和 MolProphet V1.0）篩選與 GPR75 具有高結合親和力的化合物，并通過 BODIPY 染色實驗進行功能驗證。在這些化合物中，X201415（CAS 477252-30-5）因能夠以劑量依賴方式強效抑制 HepG2 細胞脂滴積累而被鑒定出來。作者還開展了細胞熱轉移實驗，以評估 GPR75 與 X201415 之間的結合。結果顯示，X201415 可提高 GPR75 的熱穩定性。刪除 GPR75 后，X201415 的保護作用消失，提示 X201415 通過與 GPR75 相互作用來對抗肝細胞脂質積累。

為了評估 X201415 作為新型 MASH 治療候選物的藥理作用，作者在 CDAHFD 誘導的 MASH 小鼠中進行了實驗，劑量為 20 mg/kg，每日一次灌胃。結果顯示，X201415 可降低體重，組織學上減輕肝脂肪變性，并降低肝臟 TG 水平。同時，該化合物對飲食誘導的肝臟脂質合成、炎癥激活和纖維化也表現出一致的保護作用。此外，與溶媒對照相比，治療組小鼠肝臟中 cAMP-PKA 通路活化增強，SREBP-1c 蛋白水平下降。綜合來看，這些結果表明，X201415 通過靶向 GPR75 對 MASH 具有干預效果，也突出了肝臟 GPR75 作為 MASH 治療靶點的潛力。

圖7：肝臟 GPR75 是篩選 MASH 治療化合物的潛在靶點。（A）化合物 X201415 與 GPR75（綠色）結合的分子對接模型。（B）在 BSA、PA 和 X201415 處理的 HepG2 細胞中，通過 BODIPY 染色評估脂滴含量。（C）細胞熱轉移實驗（CETSA）結合 Western blot 分析評估 X201415 與 GPR75 的結合（n = 3 個生物學重復/組）。（D）HepG2 細胞中的細胞 TG 含量。（E）CDAHFD 喂養 4 周小鼠在最后 2 周每日灌胃給予 20 mg/kg/d X201415 或溶媒（CMC-Na）后的體重和肝臟重量/體重比（CMC-Na 組 n = 6，X201415 組 n = 5）。（F）肝臟和性腺白色脂肪組織（gWAT）的大體外觀。（G）肝組織切片代表性 H&E、油紅 O 和 Masson 三色染色。比例尺：200 μm（n = 3）。（H）肝臟甘油三酯（TG）和 TC 水平（n = 5–6）。（I–K）脂肪生成相關基因（I）、促炎因子（J）和纖維化相關基因（K）的 mRNA 表達（n = 5）。（L）溶媒組和 X201415 治療組小鼠肝臟中 p-PKA、總 PKA 和 SREBP-1c 的 Western blot 分析（n = 4 個生物學重復/組）。所有圖中：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns 表示無統計學意義。數據以 mean ± SEM 表示；B 和 D 采用單因素方差分析；E 和 G–L 采用雙尾非配對 Student t 檢驗。縮寫：CMC-Na，羧甲基纖維素鈉；SCR，隨機序列對照病毒；TC，總膽固醇。

【貢獻】★★★★★

總之，本研究發現，在 MASH 狀態下，肝臟中 GPR75 蛋白表達顯著升高，而不是 mRNA 水平升高。這一現象與 VPS35 的轉運功能密切相關；VPS35 在 MASH 小鼠肝臟中可增強 GPR75 蛋白穩定性，并促進其回收到細胞表面。此外，沉默 Vps35 會導致 GPR75 蛋白水平顯著下降，并伴隨 PKA 磷酸化降低及隨后 SREBP-1c 表達受到抑制。重要的是，肝臟 Gpr75 缺失可改善小鼠 MASH，提示其可能是疾病過程中的關鍵因素。肝臟 Gpr75 缺失可通過 GNAI2-cAMP-PKA 信號通路減少新生脂肪生成，顯示出作為 MASH 治療靶點的潛力。總體而言，這些發現為理解 MASH 的分子機制提供了有價值的線索，并提示了潛在治療策略的新方向。

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